陈琴华 ，朱 军 ，李 鹏

(1．湖北医药学院附属东风医院药学部，湖北 十堰 442008; 2．湖北医药学院药物分析与筛选研究所，湖北 十堰 442008)

亮菌甲素是一种香豆素类化合物，是从假密环菌中提取的有效成分之一，临床研究表明其具有降酶、退黄的作用，疗效和安全性较好[1－2]。其在水中几乎不溶，为满足临床用药需求，常需加丙二醇、聚乙二醇、吐温等增溶剂以提高溶解度。增溶剂的加入或使用不当常会引起毒副作用，降低药物的安全性。亮菌甲素琥珀酸单酯(ArAAE)是采用前药的设计方法，用琥珀酸酐将其结构中的羟甲基酰化制成琥珀酸单酯，大大改善了其水溶性[3]。高效液相色谱－质谱法(HPLC－MS)是近年来迅速发展的一项在线分离和检测的高灵敏度、高专属性、快速简便的分析技术，适用于生物样品的定性和定量分析，是药物代谢物结构分析最有效的测定方法之一，其定量分析方法绝大多数均选择离子检测，必须弄清楚被测化合物的裂解碎片[4－5]。先前为了探讨ArAAE的结构及其裂解途径，在正离子模式下建立了ArAAE的质谱裂解行为，并归属其主要特征碎片离子[2]。后来发现，ArAAE在负离子模式下测定其检测限更好。因此，本试验在负离子模式下对ArAAE进行质谱研究，为进一步研究ArAAE的体内作用过程与结构修饰提供试验依据。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂

亮菌甲素琥珀酸单酯[ArAAE，化学名为4－(3－乙酰基－7－羟基 －2－氧代－2H－色烯－5－基)甲氧基－4－氧代丁酸，本实验室合成，批号为20090422，纯度为99．6%]，化学结构式(M1)如图1;甲醇(色谱纯，美国Fisher公司);水由Milli－Q水纯化系统制备。取适量样品，用甲醇配制成质量浓度为0．5 mg/mL的待测溶液。

1．2 仪器与ESI-MSn分离条件

Agilent 1100型液相色谱－质谱联用仪(美国Agilent公司)，包括电喷雾离子化源(ESI)、LC/MS trap software 4．2工作站、Data Analysis version 2．2数据处理系统，并配有直接进样用注射泵和250 μL进样器，具有软电离和多级离子阱质谱功能。

1．3 方法

负离子检测，毛细管电压4 500 V，雾化器压力10 Psi，干燥器温度350℃，干燥器流速5 L/min，碰撞气为氦气，检测方式为MSn(n=1～4)全扫描质谱，质量扫描范围m/z100～500，蠕动注射泵直接进样，溶液流速300 μL/h。

2 结果与分析

2．1 ArAAE负离子模式下的ESI-MS和ESI-MS2质谱特征

ArAAE的ESI－MS质谱图见图1，可见ArAAE在负离子检测方式下易失去1个H－，形成准分子离子m/z333[M－H]－，且丰度较大。这表明在负离子模式下，ArAAE准分子离子ESIMS是以 [M－H]－存在且离子稳定性较好。

进一步对准分子离子m/z333[M－H]－进行二级扫描，ESI－MS2扫描质谱图质谱图见图2，出现m/z233碎片离子，其结构为M2(图2)。从图1和图2可以看出，两个离子强度分别为3．4×107和 3×107，说明 ESI－MS2丰度与 ESI－MS 的丰度相当，提示可选用m/z333＞233作为监测子离子进行ArAAE定量测定。ArAAE的裂解途径见图3。

准分子离子m/z333[M－H]－在离子肼里，以He作为碰撞气进行碰撞诱导解离，主要发生以下裂解途径:准分子离子m/z333[M－H]－从从酯键发生α裂解，产生一个丰度较高的碎片离子，即m/z233[M2]－碎片离子。

2．2 ArAAE的ESI-MS3和ESI-MS4质谱特征

图1 ArAAE的分子结构式(M1)和ESI－MS质谱图

图2

图3

在多级质谱分析中，对子离子谱影响最大的是碎裂振幅。如果碎裂振幅太高，母离子完全碎裂;如果碎裂振幅太低，母离子没有碎裂或子离子碎片过少，不便对化合物进行结构鉴定。对选定的ESI－MS2母离子m/z233逐渐加大碎裂振幅，比较不同碎裂振幅的多级质谱图，选择最佳的多级质谱分析条件，得到包含ESI－MS2母离子在内的结构信息，其碎片离子见图4A。主要产生m/z分别为 215，203，189，177，171，163，147 和 135 的 8 种丰度较大的碎片离子。进一步对3种丰度较大的碎片离子m/z203，189和163进行碎裂振幅，得出这3种ESI－MS4的质谱图分别见图 4 B(m/z203)、4 C(m/z189)和 4 D(m/z163)，其裂解图见图 5，m/z203，189 和 163 分子结构式分别为 M3、M4和 M5。M2主要有以下裂解途径:1)，从m/z203 ESI－MS4质谱图可看出其主要裂解为2个碎片离子，即M2失去一分子甲酰基(CH2O)，产生碎片离子m/z203(M3)，M3可进一步裂解而产生m/z161和135的碎片离子;2)，由m/z189质谱图可看出在He的碰撞下，产生了m/z171，159和147的3个主要碎片离子，从裂解途径可推断出是由M2失去一分子CO2，产生成m/z189(M4)的碎片离子，M4失去一分子H2O产生m/z171的碎片离子，失去一分子CH2O产生碎片离子m/z159，而失去一分子C2H2O而产生m/z147的碎片离子;3)M2失去一分子H2O形成m/z215的碎片离子，M2产生m/z163的碎片离子，进一步失去一分子H2O产生m/z145的碎片离子。从以上分析结果可见，ArAAE的裂解碎片离子见表1所示。

3 讨论

20世纪20年代，质谱技术已经广泛应用于分析领域。到了20世纪80年代，随着快原子轰击(FAB)、电喷雾(ESI)和基质辅助激光解析电离(MALD I)等软电离技术的出现，质谱的分析性能得到了极大提高，离子阱质谱仪是目前较成熟的质谱仪之一，其主要优点是在一级质谱(MS)条件下获得很强的待测物准分子离子峰，几乎不产生碎片离子，并且可借MSn(n=2～10)对准分子离子进行多级裂解，进而获得丰富的结构信息[6－7]。

图4 m/z 217(A)ESI－MS3质谱图和 m/z 203(B)、m/z 189(C)和 m/z 163(D)ESI－MS4质谱图

图5 ArAAE的ESI－MS3和ESI－MS4裂解途径

本研究中采用电喷雾电离质谱(ESI－MS)技术，对ArAAE进行质谱研究，并归属其主要特征碎片离子。可以看出，ArAAE的ESI－MS和ESI－MS2均只有1种主要的碎片离子，表明其一级准分子离子和二级碎片离子均较稳定，可以用母离子m/z333的子离子m/z233来进行药材含量测定。比较发现，其灵敏度在负离子模式下S/N更高，故提示负离子模式更加适合ArAAE药物代谢动力学的测量。ESI－MS3主要有3种裂解方式，主要产生m/z203，189和163这3种碎片离子，对其进行了 ESI－MS4测定，明确了其特征碎片离子的归属，为进一步研究ArAAE体内代谢过程与结构修饰提供试验依据。

表1 ArAAE的分子离子和碎片离子

[1]王 萍，叶 峰，刘 映，等．亮菌甲素治疗黄疸型肝炎临床观察[J]．现代医药卫生，2007，23(17):2 554 －2 555．

[2]陈琴华，李 鹏，李春钢．亮菌甲素琥珀酸单酯的正离子电喷雾离子阱质谱裂解途径的研究[J]．新乡医学院学报，2011，28(5):566－568．

[3]陈琴华，Stefanie Weibig，罗尚文，等．HPLC－MS法同时测定5种抗癫痫药的血药浓度[J]．中国科学:化学，2010，40(6):762－767．

[4]Chen QH，Luo SW，Zhang YL，et al．Development of a liquid chromatography－mass spectrometry method for the determination of ursolic acid in rat plasma and tissue:Application to the pharmacokinetic and tissue distribution study[J]．Anal Bioanal Chem，2011，399:2 877 － 2 884．

[5]李 鹏，李春钢，朱 瑜，等．反相高效液相色谱法测定亮菌甲素琥珀酸单酯注射液含量[J]．医药导报，2009，28(11):1 493－1 494．

[6]陈怀侠，沈少林，韩凤梅，等．高效液相色谱－电喷雾离子阱串联质谱分析水苏碱及其大鼠体内代谢物[J]．药学学报，2006，41(5):467－470．

[7]Ma SG，Zhu MS．Recent advances in applications of liquid chromatography－tandem mass spectrometry to the analysis of reactive drug metabolites[J]．Chem － Biol Inter，2009，179:25 － 37．