霍守俊 薛锋 孔凡志 李芳 单远州＊ 周联明＊ 张学利＊

（1.苏州大学，江苏苏州 215006；2.上海市奉贤区中心医院骨科，＊普外科，上海 201400）

胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一，胃癌患者的5年生存率仅约30%［1］，目前胃癌的发病机制尚不清楚。本课题组在前期研究中首次发现miR－650在胃癌中表达异常升高，并初步探讨了miR－650在胃癌发生、发展及预后等方面的调控作用［2］。本研究旨在进一步探讨miR－650参与胃癌发生的相关机制。

1 资料与方法

1.1 胃癌细胞株及培养 KATO III、NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45胃癌细胞株的培养条件如下：KATO III培养液为 ATCC－formulated Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium（IMDM）培养基（内含20%胎牛血清）；NUGC4、NCI－N87、SGC－7901及 MKN－45细胞株培养液均为RPMI－1640培养基（内含10%胎牛血清）；细胞孵育环境为：37℃且含95%空气、5%CO2的培养箱。

1.2 临床资料 根据美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）胃癌临床实践指南（2003版）中收录的诊疗标准，共收集68例于2005年6月—2010年1月在上海市奉贤区中心医院就诊的胃癌患者，所有患者在确诊胃癌后，限期行标准胃癌根治术并辅助放化疗，全部患者至少随访2年以上。该项研究在征得患者及家属同意后签署知情同意书，并征得上海市奉贤区中心医院伦理委员会同意。

1.3 试剂及仪器 iTRAQ试剂盒（美国ABI公司），SYBR PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），RNA提取试剂盒（德国 QIAGEN公司），IVIS Spectrum成像系统（美国冷泉港生物科技股份有限公司），LC－MS／MS系统（美国ABI公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实时定量RT－PCR 从冰冻胃癌组织及其配对正常组织中以及5株胃癌细胞株中提取总RNA，检测RNA纯度，在miR分子末端加polyA尾，选择Oligo dT引物，进行逆转录及PCR反应，记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以U6snRNA作为内参，以2－ΔΔCt表示胃癌组织中miR－650表达量相对于正常组织的变化倍数，其中ΔΔCt＝（Ct－CtU6）癌－（Ct－CtU6）正常。……