陈小娟，崔佳飞，杨延辉，关艳，张雪莲，肖春玲

·论著·

以结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用

陈小娟，崔佳飞，杨延辉，关艳，张雪莲，肖春玲

目的建立以结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶为靶点的新型抗结核药物高通量筛选模型；用此模型筛选莽草酸脱氢酶抑制剂；进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响。

分枝杆菌，结核； 酶抑制剂； 基因表达；莽草酸脱氢酶

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):191-196

近几年来结核病感染人数逐年攀升，2010 年全球结核病新增 880 万例，中国感染结核的人数已达 1.34 亿，位居世界第二，并且多药耐药结核（MDR-TB）日趋严重，同时结核病与艾滋病共感染现象的不断增加，使结核病疫情的防控面临着更为严峻的挑战[1]。因此开发新型的抗结核药物迫在眉睫。

莽草酸途径（shikimate pathway）是细菌、真菌、藻类、高等植物等合成三种必需芳香族氨基酸的必需途径[2]，本途径包括七步反应，最终生成分支酸（chorismic acid）。分支酸是合成 L-色氨酸，苯丙氨酸及酪氨酸的前体物质，同时也是合成其他芳香型化合物（诸如叶酸、泛酸和奎宁酸等）的前体物质[3]。莽草酸脱氢酶（shikimate dehydrogenase，SD）是莽草酸合成途径中的关键酶，催化莽草酸途径中的第四步反应，是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）生长所必需的，SD 利用还原型辅酶 II（NADPH）催化 3-脱氢莽草酸（3-dehydroshikimate，DHS）生成莽草酸（shikimate，SKH）[4]。人体从外界环境中摄取必需芳香族氨基酸，体内不存在莽草酸途径，因此结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶（MtSD）是一个很有发展前景的药物作用靶点。

本研究的目的是建立基于 MtSD 抑制剂的高通量筛选（high throughput screening，HTS）模型，并用此模型筛选莽草酸脱氢酶的抑制剂，进一步评价化合物对莽草酸脱氢酶活性的影响，为发现具有MtSD 抑制作用的先导化合物提供一种快速有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株 带有 MtSD 基因的表达工程菌BL21-pET-SD 由复旦大学王洪海实验室提供。耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc2155、海分枝杆菌（M. marinum）ATCC BAA-535、肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae）ATCC700603 均购自美国模式培养物集存库（ATCC）；大肠埃希菌（Escherichia coli）、铜绿色假单胞菌（p.aeruginosa）、摩氏摩根（Morganella morganii）耐药菌、枯草杆菌（Bacillus subtilis）、粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）来自本实验室；甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）R6101、变形杆菌（proteusbacillus vulgaris）为本所武临专老师实验室赠与。

1.1.2仪器与材料 His trapTMHP 亲和层析柱、AKTA 蛋白纯化仪均为美国 GE 公司产品；PCR仪、蛋白垂直电泳槽、Gel DOC 凝胶成像系统均为美国 Bio-Rad 公司产品；EnsprireTM酶标仪为美国Perkin Elmer 公司产品；LegendTMMACH1.6/R 离心机为美国 Thermo 公司产品；细胞压力破碎仪AH-100B 为北京恒奥德仪器仪表有限公司产品；Orion Model 828 型电子 pH 计为德国 Sartorius公司产品；MCV-B161Sb 超净工作台为日本SANYO 公司产品。

NADPH、NADP 购自瑞士 Roche 公司；SKH购自瑞士 Fluka 公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）购自美国 Merck 公司；蛋白质分子量标准购自加拿大 Fermentas 公司；卡那霉素、咪唑、Tris-HCl、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵购自美国 Sigma 公司；30％ 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、4 × 分离胶缓冲液、4 × 浓缩胶缓冲液、10 × 电泳缓冲液、R-250 考马斯亮蓝染液购自北京普利莱公司；吐温 80 购自美国 Amresco 公司；胰蛋白胨、酵母粉购自英国 Oxoid 公司；7H9 肉汤培养基、ADC 增菌液购自美国 BD 公司；MH肉汤培养基购自北京三药科技开发公司；氯化钠购自北京化工厂。

1.2 方法

1.2.1MtSD 的表达与纯化 将带有 MtSD 基因的 PET28b 载体转化入表达菌株 BL21 得到的表达工程菌 BL21-pET-SD 划线接种到含 50 μg/ml卡那霉素的 LB 平板上，挑取单菌落于 LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 过夜培养，以 1∶100 转接于 LB 液体培养基（含 50 μg/ml 卡那霉素），培养至 OD600约为 0.6 时加入终浓度为 0.5 mmol/L 的 IPTG，37 ℃、200 r/min 诱导表达 5 h[5]。离心收集菌体。

1.2.2MtSD 的纯化 在收集的菌体中加入裂解缓冲液[50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、0.1％ 聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、10 mmol/L咪唑]，液氮-冰水反复冻融 5 次[6]，再用细胞压力破碎仪 800 bar（1 bar = 1 × 105Pa）下破碎菌体 3 遍，12 000 × g 离心 20 min 后收集上清，利用 Ni2+亲和层析分离目的蛋白。先用洗脱缓冲液 A（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、 50 mmol/L咪唑）和 B（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、100 mmol/L咪唑）洗脱杂蛋白，然后用洗脱缓冲液 C（50 mmol/L Tris-HCl、300 mmol/L NaCl、150 mmol/L 咪唑）洗脱目的蛋白，纯化产物用 SDS-PAGE 电泳检测[7]。

1.2.3酶活及酶稳定性测定 酶活测定是利用莽草酸途径中第四步反应的逆反应，即SKH以NADP为辅酶在 MtSD 作用下生成 DHS。反应于 96 孔酶标板中进行，终体积为 100 µl。酶活测定体系包括：2 mmol/L NADP，8 mmol/L SKH，100 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0），0.3 µg SD。在 37 ℃ 下于酶标仪中检测 340 nm 的吸收值（OD340）变化。酶稳定性测定包括：处理温度（25、37、42、55、65、75 ℃）和每个温度的处理时间（0、5、10、20、30、40、50、60 min）。

1.2.4筛选条件优化及高通量筛选模型的评价 优化参数包括：反应温度（25，30，37，42，50 ℃），反应 pH 值（7 ～ 13，每隔 0.5 个 pH 取值），反应底物 SKH（16 ～ 0.0625 mmol/L，二倍稀释）和 NADP 浓度（4 ～ 0.0625 mmol/L，二倍稀释），酶量（7.77 ～ 0.68 U，二倍稀释）及 DMSO 浓度（8％ ～ 0.125％，二倍稀释）。Z' 因子法是评价HTS 模型稳定性的一种重要方法。根据公式计算Z′ 因子值：Z′ = 1 － 3（SDn + SDp）/（Vn － Vp）。其中 Vn 和 SDn 分别为阴性对照孔的酶反应速率平均值和标准差；Vp 和 SDp 分别代表阳性对照孔的酶反应速率平均值和标准差。

1.2.5酶抑制剂高通量筛选 以优化后的反应条件进行筛选，每块 96 孔酶标板上设 80 个待筛样品孔及 4 个阳性对照孔和 4 个阴性对照孔。由于目前没有已报道的 MtSD 酶抑制剂，本研究以加入热变性酶（75 ℃ 处理 30 min）作为阳性对照。每孔加入待测样品终浓度为 20 µg/ml，在 37 ℃ 条件下检测 30 min 内反应体系 OD340的变化，计算酶的反应速率。利用反应速率计算样品对 MtSD 的抑制率（R）：R（％）=（1 － VS/VN）× 100％。其中 VS代表待测样品孔的酶反应速率；VN代表阴性对照孔的平均酶反应速率。

根据以上条件，对本所化合物库中的 5 万余个化合物进行了初筛，并按照初筛的反应条件和反应方法进行复筛，根据复筛的结果确定化合物对MtSD 的抑制率。

1.2.6抑制剂半数抑制浓度（IC50）测定 采用优化后的反应条件测定，化合物浓度为 160、80、40、20、10、5、2.5、0 µg/ml，计算出抑制率后使用 origin 8.1 分析各抑制剂的 IC50。

1.2.7抑制剂 6186050 对MtSD 的动力学研究 采用优化后的反应条件，先固定 NADP 的浓度分别为 1、0.5、0.25 mmol/L，SKH 的浓度变化分别为 8、4、2、1、0.5、0 mmol/L，再固定 SKH的浓度分别为 8、4、2 mmol/L，NADP 的浓度变化分别为 1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0 mmol/L，抑制剂 6186050 的浓度分别为 12、10、0 µg/ml，在 37 ℃ 酶标仪中连续测定。

1.2.8抑制剂对某些临床分离菌包括耐药菌株的最低抑菌浓度（MIC）的测定 于 96 微孔板中进行，海分枝杆菌和耻垢分枝杆菌用 7H9 培养基，其他细菌用 MH 培养基，抑制剂的终浓度分别为128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 μg/ml，用 MH 肉汤培养基或 7H9 培养基（含 10％ ADC）二倍稀释成各种所需浓度，实验菌的接种量约为 5 × 105 cfu/ml，稀释菌液于15 min 内接种完毕。接种耻垢分枝杆菌和海分枝杆菌时，需在 7H9 培养基（含 10％ ADC）中加入0.05％ 的吐温 80。除粪肠球菌 37 ℃ 孵育 24 h和海分枝杆菌 30 ℃ 孵育 4 d 外[8]，其他菌株都是37 ℃ 孵育 18 h 观察结果[9]。

2 结果

2.1 MtSD 的表达和纯化

对表达纯化得到的MtSD 蛋白进行 SDSPAGE 分析，相对分子质量约为 29 kD。虽然大部分表达的MtSD 蛋白在沉淀中，但上清经纯化后在SDS-PAGE 上也看到明显的目的条带，并且条带是单一的（图 1）。

图1 MtSD SDS-PAGE 图谱Figure 1 SDS-PAGE of expressed and purifiedMtSD protein

2.2 酶活测定

在MtSD 的作用下 SKH 苯环上的 3 位脱去一个氢离子转移到 NADP 上，生成NADPH，通过检测体系中的 NADPH 的浓度来反映MtSD 的酶活。NADPH 的浓度与OD340 成线性关系（图 2）。

MtSD 酶活力的定义：37 ℃ 条件下反应，每分钟催化生成 1 nmol/L NADPH 的酶量设定为1 U。纯化后MtSD 为 0.272 mg/ml，酶比活力为20987 U/mg。并且酶反应速率与酶量成线性关系（图 3）。

图2 NADPH 浓度与OD340 关系Figure 2 The relationship between the concentration of NADPH andOD340

图3 酶量与反应速度关系Figure 3 The relationship between the quantity and raction rate ofMtSD

图4 MtSD 稳定性Figure 4 The stability ofMtSD

2.3 酶稳定性测定

MtSD 在 25、37、42 ℃ 处理 1 h 内处于稳定状态；55 ℃ 时随着处理时间的延长酶活逐渐下降；65 ℃ 处理 40 min 后、75 ℃ 处理 20 min 后MtSD 已失活（图 4）。

2.4 筛选条件优化和高通量筛选模型的评价

随着温度的升高MtSD 反应速度增加，为便于实验的操作，选择 37 ℃ 为筛选温度；体系中 pH值为 12 时酶活力达到最大，但此时反应体系不稳定，故筛选的 pH 值确定为 9；最佳 SKH 浓度为8 mmol/L；最佳 NADP 浓度为 1 mmol/L；最佳酶量为 0.3 μg，即 2.5 U；DMSO 在 ≥ 0.5％ 时对MtSD 活力产生影响，因此在筛选时阴性对照和空白对照必须加入与实验组等体积的 DMSO，消除DMSO 对酶活造成的影响（图 5）。

图5 筛选条件优化（A：最适温度；B：最适 pH；C：最佳 SKH 浓度；D：最佳 NADP 浓度；E：最佳酶量；F：DMSO浓度对酶活的影响）Figure 5 Optimization of screening conditions (A: Optimization of temperature; B: Optimization of pH; C: Optimization of the SKH concentration; D: Optimization of the NADP concentration; E: Optimization of the enzyme concentration; F: Effect of the DMSO concentration)

目前广泛使用的 HTS 模型的稳定性和可靠性评估参数是Z′ 因子[10]，它是一个统计学参数，与筛选源无关，仅与筛选方法本身有关。一般认为，如果 1 ＞Z′ ＞ 0.5，说明该筛选模型是比较理想的适合于 HTS 的方法；如果Z′ ＜ 0.5，则说明筛选方法还需要调整。本实验中 HTS 的Z' 因子值为0.76 ± 0.04。因此，所建立的筛选方法是一种稳定性和灵敏度都较好的 HTS 方法。

2.5 MtSD 抑制剂的筛选及 IC50

采用建立的 HTS 筛选模型，对本所 5 万余个化合物进行筛选，得到 9 个抑制率 ＞ 20％ 的化合物，并分别测定它们的 IC50。化合物编号、对MtSD的抑制率及 IC50如表 1。

2.6 抑制剂 6186050 对MtSD 的动力学研究

由于抑制剂 6186050 的 IC50相对较低，对其动力学进行研究。NADP 为 1 mmol/L 时，抑制剂6186050 以竞争的方式抑制MtSD 的活性（图 6），抑制常数Ki为 4.9 μmol/L。

2.7 抑制剂对某些临床分离菌包括耐药菌株的最低抑菌浓度（MIC）的测定

经过 3 次的重复实验，具有抑菌活性的抑制剂对菌株的 MIC 如表 2 所示。

表1 各活性化合物对MtSD 抑制率及 IC50Table 1 The inhibition ratio of active compoundsfor recombinantMtSD and IC50

图6 抑制剂 6186050 动力学Figure 6 The kinetics of inhibitor 6186050

表2 抑制剂对菌株的 MICTable 2 The MIC of inhibitors to bacterial strains

3 讨论

MtSD 是 MTB 莽草酸代谢途径中关键酶，重组工程菌 37 ℃ IPTG 诱导和 20 ℃ 自诱导 24 h后，大部分表达的MtSD 蛋白都以包涵体的形式存在，对其氨基酸序列分析，发现序列中具有三个半胱氨酸，因而在大肠杆菌中表达很容易由于不正确折叠而形成包涵体。查阅相关的文献[5-6]后，确立使用反复冻融 5 次再压力破碎的方法裂解菌体，可使菌体中可溶性的MtSD 得到充分释放，另外在裂解缓冲液中加入 0.1％ 的 Triton 能提高可溶性MtSD 的产量。对纯化过程中的各组分进行收集，发现柱子流穿液和杂峰洗脱液中都能检测到MtSD活性，离心沉淀不具有活性，说明MtSD 跟 His 亲和柱结合能力不强。

本实验依据反应产物 NADPH 的吸收特性对MtSD 蛋白的活性进行测定，通过对反应体系的温度、pH、底物浓度、酶量、DMSO 等条件的优化，建立了MtSD 抑制剂的 HTS筛选模型，其Z′ 因子值达到了0.76 ± 0.04。通过对本所 5 万余个化合物进行筛选，表明该模型快速、灵敏、稳定等特点，为寻找和发现MtSD抑制剂提供了一种新的技术和方法。

对 Helen A. Arcuri 同源模建的MtSD 结构分析，NADPH 结合的区域在 N 端，其催化区域分布在 C 端，并且 NADPH 的结合对蛋白的结构变化不大[11]，抑制剂 6186050 与NADPH 竞争性结合，因此抑制剂 6186050 与MtSD 相互作用后可能对酶的空间结构不会产生太大影响，当然这还需实验证实。抑制剂 6230384 和 6186050 对海分枝杆菌的 MIC都是 32 μg/ml，MTB 和海分枝杆菌的SD 酶（YP_001850477.1）的同源性高达 83％，而且海分枝杆菌在遗传上是与 MTB 关系最近的：基因组序列有 85％ 与 MTB 具有同源性[12]，这些抑制剂的抗结核活性还需要进一步验证。

志谢感谢上海复旦大学王洪海老师实验室提供的 SD 表达工程菌株。

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Establishment and application of a high-throughput screening model targeting to shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv

CHEN Xiao-juan, CUI Jia-fei, YANG Yan-hui, GUAN Yan, ZHANG Xue-lian, XIAO Chun-ling

ObjectiveTo establish a high-throughput screening (HTS) model targeting Mycobacterium tuberculosis shikimate dehydrogenase (MtSD) for the discovery of novel antituberculosis drugs. The established model was used to screen inhibitors targeting MtSD and to explore the effects of compounds on the activity of SD.MethodsAfter expression and purification, MtSD activity was measured by detecting the absorption of NADPH at 340 nm wavelength in solution. HTS was established based on the activity of SD and Z' factors were used to evaluate the quality of the HTS model. 50 000 compounds were screened by using this model and IC50of inhibitors were determined, besides the enzyme kinetics of inhibitor 6186050 was investigated. Some bacterial strains segregated from clinical were evaluated for the effect of inhibitors by the method of diluting liquid.ResultsRecombinant MtSD was successfully obtained and has the optimal activity 20987 U/mg. The parameter Z' factor was 0.76. It was suggested that the model was highly feasible and stable for HTS drug screening. 9 compounds were found to inhibit MtSD using the HTS model, and the inhibitory effect of inhibitor 6185020 on the activity of SD was reversible. Both of the MIC of inhibitors 6230384 and 6186050 were 32 μg/ml for Mycobacterium marinum.ConclusionA steady and sensitive HTS model for potential MtSD inhibitors was established. The hits of MtSD inhibitors possess bacteriostasis activity.

Mycobacterium tuberculosis; Enzyme inhibitors; Gene expression; Shikimate dehydrogenase

s:ZHANG Xue-lian, Email: xuelianzhang@fudan.edu.cn; XIAO Chun-ling, Email: xiaoc1318@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.006

“重大传染病防治”科技重大专项（2008ZX10003-006）

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（陈小娟、崔佳飞、杨延辉、关艳、肖春玲）；200433 上海，复旦大学生命科学学院遗传所遗传工程国家重点实验室（张雪莲）

张雪莲，Email：xuelianzhang@fudan.edu.cn；肖春玲，Email：xiaoc1318@163.com

2012-02-24

方法表达并纯化结核分枝杆菌 H37Rv 莽草酸脱氢酶；利用还原型辅酶 II（NADPH）在溶液中的光吸收，测定酶的活性，构建了该酶抑制剂的高通量筛选模型；用 Z′ 因子法评价该模型的可靠性，并对 5 万余个化合物进行筛选；测定了各抑制剂的 IC50并对抑制剂 6186050 的酶抑制动力学进行了研究；用菌液稀释法评价了抑制剂对某些临床分离菌株包括耐药菌株的影响。

结果得到了重组莽草酸脱氢酶；测得比活力为 20987 U/mg，所建的莽草酸脱氢酶高通量筛选模型 Z′ 因子为 0.76，符合高通量筛选的要求；对 5 万余个化合物进行筛选得到 9 个抑制率较高的化合物；抑制剂 6186050 为竞争性可逆抑制剂；抑制剂 6230384 和 6186050 对海分枝杆菌的最低抑菌浓度（MIC）都是 32 μg/ml。

结论建立了稳定性好、灵敏度较高的结核分枝杆菌莽草酸脱氢酶抑制剂高通量药物筛选模型，应用该模型筛选得到的抑制剂可能具有抑菌活性。

Author Affiliations:National Laboratory for Screening New Microbial Drugs, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking Union medical college, Beijing 100050, China (CHEN Xiao-juan, CUI Jia-fei, YANG Yan-hui, GUAN Yan, XIAO Chun-ling); State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Genetics, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China (ZHANG Xue-lian)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):191-196