史桂梅 钟红平 刘世平

铜绿假单胞菌(psedom onas aeruginas，Pa)是目前难治性医院感染的主要致病菌，主要原因是Pa多重耐药(multidrug－resistance，MDR)株不断出现［1］。耐药结节细胞分化家族(resistance nodulation cell division family，RND)是细菌外排泵系统之一，在Pa的多重耐药中起着重要作用［2，3］。本文探讨多药耐药Pa的9种外排泵系统表达的分布趋势及其感染危险因素，为临床防治铜绿假单胞菌多重耐药的产生提供理论支持。

材料与方法

1.菌株来源:收集2008年1月～2010年12月笔者医院儿科多重耐药Pa感染病例97例。年龄为出生后7天～12岁，平均年龄7.8岁，其中痰标本37例，血标本29例，创面标本18例，导管标本8例，其他标本5例，菌株均经VITEK－Am s60全自动细菌鉴定系统和常规生化检测鉴定。

2.主要仪器试剂:荧光定量PCR仪、电泳仪、核酸蛋白分析仪、低温高速离心机、凝胶成像分析系统。TRIzol RNA提取液，Prime Script RT reagent Kit Perfect Real time试剂盒及Premix Taq Version 2.0，ABI7500荧光定量专用96孔板，琼脂糖，异丙醇，三氯甲烷，无水乙醇等分析纯。

3.实验方法:(1)细菌处理:收集临床标本培养的多重耐药Pa株，先用LB培养基摇菌增菌，后加入无菌甘油(20%终浓度)，－80℃冰箱保存待用。(2)基因检测:1)引物设计:参考文献进行PCR引物设计，所有PCR产物(＞150bp)进行双向测序，所测各基因序列与Pubmed数据库中相关基因进行Blast比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)［4～8］。2)细菌总RNA提取、cDNA的合成及反转录反应:LB培养基摇菌增菌，后加入无菌甘油，－80℃冰箱保存待用。提取总RNA之前置于冰上复温，然后接种于LB培养基中，240r/min，37℃振摇16～18h，取菌液3ml，4000r/min，离心3min，弃上清，加1m l TRIzol RNA提取试剂盒，按说明步骤提细菌总RNA，然后行凝胶电泳测RNA完整性，选择3条带清晰，A260/ A280=1.8～2.0的细菌总RNA行反转录反应，按试剂盒说明操作。……