熊思华，刘红梅，孙海晨

创伤性颅脑损伤(TBI)是导致青壮年患者死亡和残疾的主要病因之一。近期一项包含2 664例重型颅脑损伤(GCS＜9分)患者的国际回顾性研究中［1］，TBI死亡率高达28%。许多患者虽然存活下来，却留有神经功能障碍。伤后6个月，只有52%的患者生活可基本自理。也就是说，48%的患者死亡或严重残疾。这些结论被随后的前瞻性研究证实，包含363例重型颅脑损伤患者的澳大利亚多中心研究(ATBIS)［2］发现，1年死亡率高达35.1%，预后良好率为48.5%。另一晶胶体复苏随机对照研究(SAFE)［3］中，重型颅脑损伤2年死亡率和预后良好率分别是32%和46%。严重颅脑损伤的高死亡率、高致残率给个人、家庭乃至整个社会带来了巨大的精神和物质负担，除完善相关法律、法规，预防创伤意外的发生，改善颅脑损伤预后的研究也一直是医学界的重点和热点。然而，既往临床研究中，除了手术清除大血肿外，尚未发现能真正改善脑损伤预后的治疗方法。但是近年来越来越多的研究表明，促红细胞生成素(Epo)有望成为改善TBI预后的有效药物，Epo是通过与促红细胞生成素受体(EpoR)结合发挥脑保护作用的。本文将综述Epo/EpoR系统在颅脑损伤中的研究进展。

1 Epo/EpoR系统的结构基础及信号传导

1.1 Epo Epo是一种由166个氨基酸残基组成的糖蛋白，分子量34kDa，属于I型细胞因子超家族。Epo产生与分泌的过程中，在多肽链的氨基端切掉由27个氨基酸残基组成的疏水性分泌引导肽，成为由166个氨基酸残基组成的肽链［4］。在成熟Epo羧基端166位的精氨酸被切除掉，这样，循环中的Epo是由165个氨基酸残基组成［4］。糖类约占Epo总分子质量的40%，总共有4条糖链，糖链对于Epo的生物活性是必须的，其可以稳定Epo的结构，避免氧自由基对Epo结构的破坏［4］。天然存在的Epo分为α型和β型，两者只是碳水化合物含量不同，其生物学特性及临床效果基本相同。

1.2 EpoR EpoR是一种由508个氨基酸组成的跨膜蛋白质，人与鼠有82%的同源性［5］。其结构可分为3部分:胞膜外部分、跨膜区、胞内区部分［5］。胞膜外部分有226个氨基酸，氨基端连接由24个氨基酸组成的信号肽;跨膜区由22个疏水氨基酸构成;胞内区缺少酪氨酸激酶的特征排列顺序，故不具备酪氨酸激酶活性;靠近跨膜区的胞内区含基因转录调控相关蛋白结构域(Box1)和Box2两个高度保守的结构域单元，Box1是EpoR与酪氨酸激酶相联系的部位，蛋白酪氨酸激酶-2(JAK2)是一种非受体型酪氨酸激酶，它通过Box1与EpoR结合，激活后可发挥其激酶活性［5］。JAK2的活性对介导Epo发挥生物效应是至关重要的，若去除EpoR，Box1不能激活JAK2，也就不能引起相关生物效应［5］。EpoR胞内区含8个酪氨酸残基，Epo刺激使其发生磷酸化，这些磷酸化位点是EpoR与效应蛋白的结合部位［5］。EpoR与Epo结合并诱导细胞内泛素化后将被蛋白酶和溶酶体降解，很少有EpoR能在细胞膜上循环利用［6］。

1.3 Epo/EpoR信号传导路径 Epo与EpoR结合后可促进EpoR交联形成二聚体，导致EpoR相关的酪氨酸激酶JAK2自身磷酸化，使其下游的多个信号途径磷酸化。近期研究表明，主要信号途径有胞内开关蛋白(Ras)细胞分裂素活化蛋白激酶(Ras/MAPK)、磷脂酰肌醇激酶-3(PI3-k)、信号转录与转导活化因子5(STAT5)和核因子-κB(NF-κB)，从而导致了一系列抗凋亡机制的启动［7］。

2 Epo/EpoR的表达与调节

既往研究认为，正常人体内Epo水平很低，组织低氧是促使肾脏生成Epo的诱因。确切的说，Epo基因表达的增加是由低氧诱导转录因子(HIF)诱导的，新合成的Epo刺激红系细胞生成，从而提高血供氧量。传统观点认为，Epo仅仅作用于红系细胞，Epo通过EpoR刺激红系祖细胞的增殖和分化。近20年的研究发现，除肾脏外，脑、肝和子宫等脏器也可产生Epo。Epo还可因损伤、代谢应激等诱因合成增加，对大脑、脊髓、心脏有保护作用［8］。

除红系细胞，内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和神经细胞中也发现了EpoR［9］。机体损伤时调节EpoR表达的机制尚未明确，EpoR的表达似乎不仅仅由HIF调节，白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性因子和Epo都可调节EpoR的表达［10］。Chen等［11］发现，组织低氧时诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂可阻止EpoR的表达的上调。低氧时，诱导型一氧化氮合酶可致NO合成显著增加，诱导型一氧化氮合酶抑制剂可使NO合成减少，由此可知，EpoR还受NO的调节。

Epo/EpoR在正常成人脑组织内呈低表达状态。当受到各种类型的脑损伤时，Epo/EpoR表达显著增加，但Epo升高迟于EpoR，造成Epo相对不足，外源性应用Epo可促进TBI后的神经功能恢复［12］。研究发现，Epo主要由星形胶质细胞产生，少突胶质细胞、神经元也能产生Epo，与邻近神经元、星型胶质细胞、内皮细胞、小胶质细胞上的EpoR结合，发挥神经保护作用［13］。既往认为，血-脑脊液屏障阻止了肾脏来源的循环Epo的通过，Epo可通过旁分泌和自分泌的方式作用于神经元，不依赖于内分泌Epo系统，外源性应用Epo治疗颅脑损伤是无效的。但是随后的研究表明，Epo不仅可以通过颅脑损伤后被破坏的血-脑脊液屏障，还能通过完整的无损伤的血-脑脊液屏障［14］。Liao等［15］发现EpoR水平在TBI后7d仍呈明显升高，而内源性Epo则短暂升高，之后便降至正常水平。通过实验处理使内源性EpoR溶解可加重脑损伤程度，因Epo无法与足够的EpoR结合，说明内源性Epo通过固定的信号传导模式参与神经修复，Epo和EpoR缺一不可。在对EpoR表达缺失的转基因大鼠的创伤研究中，脑组织的神经细胞凋亡数增加，神经细胞分化减少，神经细胞对低氧、谷氨酸兴奋性毒性比正常细胞更敏感［16］。Epo治疗EpoR缺失的转基因大鼠时，Epo的神经保护作用未被发现，这说明EpoR对于脑保护是不可或缺的。此外，研究者们［17］还发现，对于脑组织EpoR缺失而造血系统EpoR高表达的转基因大鼠，Epo仍保留了部分的神经保护作用，如减少大脑皮质和海马组织损伤，该实验提示Epo部分神经保护作用很有可能是通过血管EpoR介导的。

3 Epo/EpoR系统的脑保护作用与机制

大量的实验和临床研究表明，继发性脑损伤是TBI致死和致残的主要原因，表现为脑水肿、脑血流紊乱、血-脑脊液屏障通透性改变、神经细胞死亡［18］。急性脑损伤后，生化传导路径的激活使炎症反应、氧化应激、血管通透性和细胞兴奋性毒性升高，导致脑细胞死亡加剧，低氧面积增加甚至全脑损伤［18］。Epo可减少脑挫伤面积、细胞损伤、脑水肿程度，甚至还能恢复认知功能，改善空间记忆［19］。Epo的保护效应机制主要有:

3.1 抗凋亡作用 促凋亡基因Bal2相关的促凋亡基因(Bax)和DP5表达下调，STAT-5和B细胞淋巴瘤/白血病2基因表达上调可减少凋亡细胞。有趣的是，Epo介导的抗凋亡路径需与蛋白激酶Akt-1紧密结合。例如Epo通过抑制转录因子3a的核易位来阻止凋亡基因的翻译，Epo还可促进NF-κB向细胞核内转移来激活抗凋亡基因［20］。

3.2 抗细胞兴奋性毒性 脑创伤时，谷氨酸受体的过度激活将致神经细胞死亡。一些实验已经证明，兴奋性毒性应激时，预防性给予Epo可提高神经细胞体外培养的存活率，因Epo诱导钙离子依赖的谷氨酸盐的释放减少，增强了神经细胞抵抗谷氨酸盐毒性的能力［21］。Epo还能促进IL-10的表达，从而抑制促凋亡细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的活性，最终阻断谷氨酸诱导的小脑颗粒细胞死亡。

3.3 抗氧化应激 在体外神经细胞培养试验中，Epo减少了氧化应激后的细胞死亡数。在体内试验中，Epo可以降低新生小鼠脑缺血、低氧后脂质过氧化的水平，增加抗氧化酶活性，说明Epo有直接的抗氧化作用。Sims等［22］应用相似的试验方法发现，Epo可增加由神经干细胞分化而来的不同功能的神经细胞内半胱氨酸-谷氨酸盐转化能力，从而增强细胞内氧化还原体系的防御能力。Epo还可通过抑制iNOs的活性来减轻脑缺血损伤，NO是一种强作用的氧自由基，是机体内主要的过氧化物之一，这也说明Epo具有间接的抗氧化效能。

3.4 保护血-脑脊液屏障，减轻脑水肿，为脑损伤部位储存氧供 TBI时内皮细胞功能障碍将破坏血-脑脊液屏障，导致脑水肿和炎症反应。以牛的血-脑脊液屏障为研究对象，Wang等［23］发现Epo可阻止内皮生长因子介导的血-脑脊液屏障通透性改变。随后其他研究者还发现Epo可修复内皮的连接咬合蛋白(α-连接蛋白、β-连接蛋白)，此作用可对抗TBI后的血管源性水肿。Epo还可限制水通道蛋白4(AQP4)介导的星型胶质细胞肿胀，脑水肿和神经系统症状。抑制神经型NO合酶(nNOS)的活性，减少相应NO的生成也是Epo减轻脑水肿的机制之一。同时，Epo可增强内皮型NO合酶的活性，促进该类NO的生成，从而舒张血管以改善血供，提高氧供。

3.5 减轻脑损伤后缺血部位的炎症反应 Epo可降低TBI后相关的炎性因子如IL-1β、TNF-α、细胞间黏附分子(ICAM-1)的水平［22］。Epo的抗炎性效应很有可能是通过稳定血-脑脊液屏障，减轻脑损伤后的神经细胞死亡，而不是通过与表达EpoR的炎性细胞结合实现的，该过程还可减少损伤部位包括炎性因子在内的趋化因子的聚集。

3.6 诱导神经元修复 以上所述的机制都是Epo针对急性脑损伤所起的保护作用，损伤后的神经修复方面，Epo是否有作用呢?Epo可通过促进神经母细胞向脑损伤缺血区迁移，促使神经细胞的新生，加强神经功能的恢复。该作用很有可能与经PI3-K/Akt-1途径调节基质金属蛋白酶-9(MM9)、MM2蛋白激酶的分泌过程有关［23］。

4 Epo及EpoR的临床应用与探讨

编码Epo的cDNA已被成功分离，重组人Epo(rhEpo)的研究也早已获得成功。rhEpo主要用于治疗肾性贫血和外科手术前的红细胞动员，对新生儿贫血、癌相关贫血，免疫性疾病伴发的贫血也有治疗作用。近年，越来越多的证据表明，Epo是一种多功能因子，外源性应用rhEpo可在机体损伤时对多种器官发挥保护作用，这一作用与骨髓造血无关。

虽然目前尚未有Epo用于治疗TBI的临床前瞻性研究，但是目前有一些资料间接提示外源性应用rhEpo可能对严重TBI的患者有效，与对照组比较，rhEpo治疗组可显著降低住院期间的死亡率［24］。Corwin等［25］在一项最初研究rhEpo能否减少危重病患者输血率的大型临床Ⅱ期试验的后期亚组数据分析发现:皮下注射rhEpo有降低创伤患者死亡率的趋势。这一结果促使研究者们进行了一项更大规模的Ⅲ期临床前瞻性研究［26］，该研究人群涉及内科、外科手术和创伤危重病患者，并将Epo能否降低死亡率设为研究目标。实验结果表明，相对于空白对照组，每周1次皮下注射rhEpo 40 000U(连续3周)可降低重症创伤患者29d及140d的死亡率。从已知的动物实验来看，rhEpo要发挥脑保护作用，其用量远远大于常规治疗贫血的剂量，这样就容易导致副作用如静脉血栓。有限的临床研究确实也发现大剂量应用rhEpo可导致静脉血栓发生率明显升高［26－27］。目前，临床应用rhEpo的途径、剂量、频率还未有统一结论。可以肯定的是大剂量、长时间的应用是临床应用的一大趋势，而如何有效避免严重并发症是其中的关键。目前有三项致力于评估Epo治疗TBI安全性和有效性的试验正在进行(NCT00260052;NCT00313716;NCT00375869)，相信将为临床运用rhEpo治疗TBI提供可靠的证据。同时，rhEpo分子起保护作用的区域已明确，非促红细胞生成的Epo变构体(如氨基甲酰化Epo)可保留神经保护作用同时又无因刺激造血系统导致的并发症［28］。Epo变构体正积极研制中，其临床应用前景十分可观，但在此之前仍需大量的试验研究。

Liao等［15］发现小鼠体内EpoR水平在重型TBI后7d仍呈明显升高，而Epo水平在短暂升高后恢复正常水平，该趋势提示外源性应用rhEpo的可行性。动物体内Epo、EpoR的变化趋势经多项实验已基本明确，不过也仅限于颅脑损伤，近期有研究提示rhEpo对失血性休克的动物也有脏器保护作用［29－30］。那么，休克动物体内的Epo、EpoR的变化又是怎样的趋势?是与TBI类似，还是存在不同的规律?另外，Epo、EpoR的表达研究多限于动物实验，人体内两者的表达情况尚不明确。对于不同损伤程度及损伤类型的患者，Epo、EpoR的表达又有怎样的不同，两者的上升水平及持续时间是否与损伤程度、损伤类型有关?从已知的研究来看，EpoR的变化趋势是机体的自我保护性应对策略，那么损伤后期EpoR的水平是否可作为提示预后的有效参数?笔者认为，只有解决了上述问题，才能为临床应用rhEpo提供有力的理论依据，还能为临床评估创伤患者预后提供可靠的指标。

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