丁博文，嵇 武，白小武，车金辉，张 强，李秋荣

肠黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障、微生物屏障和化学屏障，机械屏障是肠黏膜屏障的基础和最重要的部分［1］。紧密连接形成的连续环周上皮细胞间连接，是构成肠黏膜机械屏障最重要的结构［2］。大黄素是中药大黄的重要单体，具有多种功效，如抑菌、抗炎、改善微循环、抗癌等，具有较好的临床应用价值［3］，近来有研究证实大黄素对肠黏膜屏障具有一定的保护作用。本实验通过建立肠上皮细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)模型，研究大黄素对紧密连接蛋白的影响，探讨大黄素保护肠黏膜屏障的内在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肠上皮细胞株Caco-2 细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所)、大黄素(江苏食品药品检定所，纯度＞99.9%)、Mllicell 插入式培养皿(Millipore 公司)、兔抗鼠多克隆紧密连接蛋白Occludin 和ZO-1 抗体(Santa Cruz 公司)、辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔二抗(Sigma 公司)、RT-PCR 试剂盒(北京全式金生物公司)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物(北京全式金生物公司)。

1.2 主要实验仪器 紫外分光光度计(Beckman Coulter)、JEM-1010 透射电子显微镜(日本电子株式会社)、MillicellTM 电阻测定系统(Millipore 公司)。

1.3 Caco-2 细胞的培养 Caco-2 细胞在37℃、5%CO2和90%相对湿度的CO2培养箱中培养，2 ～3 d换液一次，每5 d 按1:3 的比例传代。Caco-2 细胞接种于6 孔培养板内，供Western-blot 及RT-PCR 分析;接种于Millicell 聚碳酸酯膜(4.5cm2，0.4 μm)，供跨上皮电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)的检测及透射电镜分析。

1.4 Caco-2 细胞H/R 损伤模型的建立方法 取生长达到80%～90%融合的Caco-2 细胞，随机分为四组:正常细胞(N)组、H/R 组、缺氧复氧+Hanks 平衡盐溶液(H/R+HBSS)组、缺氧复氧+大黄素(H/R+EN)组。H/R+EN 组细胞在H/R 前30 min 用10 μmol/L 大黄素处理。将细胞置入密闭容器中，通入95%N2、5%CO2的混合气体后将容器置于培养箱中孵育90 min(缺氧)，取出，置入培养箱中孵育2 h(复氧)。……