王新国 张思泉 刘华锋

(杭州市第六人民医院,浙江 杭州 310014)

目前,肝细胞生长因子(hepatic growth factor,HGF)因促进成熟肝细胞增殖而用于重型肝炎的治疗,取得良好效果。但HGF调节细胞增殖需一氧化氮(NO)的介导[1],后者与硫化氢(Hydrogen sulfide,H2S)同为气体调节分子,共同调节细胞生物学功能[2]。然而,硫化氢对肝细胞的增殖调节尚不明确。本研究硫化氢对感染HBV肝细胞增殖的影响和相应信号通路改变,为临床治疗慢性乙型重型肝炎提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010年1月～2011年12月入住本院25例慢性乙型肝炎患者作为观察对象。年龄 21～35岁;男 15例 ,女 10例;HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性,乙肝病毒载量 ＞104copies/mL,ALT、AST 50～150U/L,胆红素 7.9～21μmol/L。

1.2 标本的采集 在B超定位下,穿刺肝组织1.5～2.0cm,无菌注射器针头从肝穿枪组织槽中截取组织0.8～1.0cm放入预冷(4℃)D-Hanks液中,10分钟之内进行肝细胞分离。

1.3 肝脏细胞分离与冻存 首先用眼科剪剪碎肝组织至糊状,然后用缓冲液充分清洗并加入0.05%的IV型胶原酶液进行消化30分钟,再用D-Hank’s液清洗,最后加入含有血清的RPMl 1640培养液终止胰酶的作用,得到消化彻底的细胞悬液。200目筛网过滤及低速离心纯化肝细胞(800g5分钟)。分离纯化后的采用两步法冻存。取无菌冻存管(2mL)1支将细胞用自制的冻存液(RPMI 1640+30%FBS+双抗+0.1U/mL胰岛素+2%DMSO)制成1×105/mL细胞悬液,置-20℃2小时后冻存于-70℃冰箱内冻存。

1.4 硫化氢对肝细胞增殖的影响 为探讨硫化氢对肝炎肝细胞增殖和通路影响,冻存肝细胞复苏,培养24小时后,用台盼兰拒染色法评估细胞活性。并分成肝炎细胞组(C),肝炎细胞+HGF组,肝炎细胞+炔丙基甘氨酸(Propargylglycine,PPG;2mmol/L)+HGF组,肝炎肝细胞+NaHS(硫化氢供体,1mmol/L)+HGF组,调肝细胞浓度为5×103/mL,每组设3个复孔,24小时测定MTT。PPG为胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase,CSE)抑制剂。

1.5 硫化氢对肝细胞增殖的Ras-ERK通路的影响 上一步骤细胞培养24小时,离心(800g 5分钟),收集细胞,加蛋白上样Buffer 300μL,超声粉碎细胞(350焦耳5秒),煮沸5分钟,冰上冷却,上样,PAGE电泳,PVDF膜印记,脱脂奶粉封闭1小时,PRas、ERK(P-ERK)、β-actin 一抗 4℃冰箱孵育过夜,二抗室温孵育1小时,ECL显色,曝光。

1.6 统计学处理 用SPSS13.0统计学软件对数据进行方差分析,数据用(表示,两组数据之间LSD-t检验。

2 结 果

2.1 肝细胞活性 细胞经过冻存后复苏,再培养24小时,台盼兰拒染色实验显示细胞活性＞90%,见图1。

图1 肝细胞复苏后细胞活力情况

2.2 细胞增殖情况 HGF组肝细胞吸光度值明显增加：应用CSE抑制剂 PPG减少内源性硫化氢,肝细胞吸光度值增加更加明显,细胞增殖亦明显;加NaHS后,肝细胞吸光度值明显减小。

图2 各组肝细胞增殖情况

图3 各组Ras-ERK的磷酸化情况

2.3 肝细胞Ras-ERK的磷酸化活化 HGF促肝细胞增殖时,Ras-ERK磷酸化增强;PPG抑制内源性硫化氢时,Ras-ERK磷酸化减弱,加用硫氢酸钠后Ras-ERK磷酸化增强。

3 讨 论

肝细胞再生是慢性乙型肝炎基础上重型肝炎(尤其中、晚期的患者)治疗的关键环节。HGF因激活Ras-ERK通路[3],促肝细胞增生明确,被广泛用于临床。但是,应用HGF治疗后,患者死亡率仍居高不下[4],这与肝细胞再生的调节机制复杂有关。

肝脏是硫化氢产生的主要器官,先后通过胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-γ-裂解酶催化L-半胱氨酸产生硫化氢[5]。作者前期研究显示,在肝炎和肝硬化形成和发展过程中,内源性硫化氢发生改变;外加硫化氢供体和干扰内源性硫化氢的产生均能改变肝病发展进程[6-7],提示硫化氢调节肝病的发生和发展。本文用CSE抑制剂和硫化氢供体NaHS干预后,慢性乙型肝炎肝细胞的增殖功能发生明显改变,再次体外证实硫化氢调节肝细胞再生增殖。

细胞增殖的调节机制和信号通路是当前研究的热点和重点,其中Ras/RAF/ERK途径是肝细胞增殖的重要通路。为观察硫化氢对此通路的作用,本研究应用 HGF激活 Ras-ERK,观察硫化氢对Ras、ERK磷酸化的影响。结果显示硫化氢促进Ras、ERK的活化磷酸化;利用CSE抑制剂 PPG后,ERK磷酸化减弱,这与文献研究硫化氢对ERK的磷酸化作用相一致[8]。然而,通常Ras-ERK活化后细胞明显增殖,而本实验则显示增殖抑制,目前尚无确切的资料解释此现象。这可能与其同时激活凋亡机制有关,也可能与其激活P38MAPK有关[9]。

文献报道硫化氢可以活化多种增殖信号通路[10],目前尚未明确硫化氢是否作用各种活化通路的共同靶点或机制。尽管如此,本研究表明硫化氢具有抑制肝细胞增殖功能和促进Ras-ERK活化作用。

[1] Vazquez-Chantada M,Ariz U,Varela-Rey M,et al.Evidencefor LKB1/AMP-activated protein kinase/endothelial nitric oxide synthase cascade regulated by hepatocyte growth factor,S-adenosylmethionine,and nitric oxide in hepatocyte proliferation.Hepatology,2009,49(2)：608

[2] Kajimura M,Fukuda R,Bateman RM,et al.Interactionsof multiple gas-transducing systems：hallmarks and uncertainties of CO,NO,and H2Sgas biology.Antioxid Redox Signal,2010,13(2)：157

[3] Li F,Jiang Y,Zheng Q,et al.TEC protein tyrosine kinase is involved in the Erk signaling pathway induced by HGF.Biochem Biophys Res Commun,2011,404(1)：79

[4] 周永裕.肝细胞生长素治疗重型肝炎40例的疗效观察.广西医学 ,2000,22(4) ：800

[5] 王新国,袁建国.内源性硫化氢研究进展.实用医学,2007,23(11)：1765

[6] 袁建国,王新国,王风华,等.急性肝损伤大鼠肝组织中胱硫醚-γ-裂解酶动态变化及意义.山东医药,2008,48(11)：36

[7] 王新国,袁建国,张丽旦,等.硫化氢对肝硬化胶原蛋白的影响.国际流行病学传染病学杂志,2011,38(4)：232

[8] Yang G,Cao K,Wu L,et al.Cystathionine gamma-lyaseover expression inhibitscell proliferation via a H2S-dependent modulation of ERK1/2 phosphorylation and p21Cip/WAK-1.Biol Chem,2004,279(47)：49199

[9] Adhikari S,Bhatia M.H2S-induced pancreatic acinar cell apoptosis is mediated via JNKand p38 MAPkinase.J Cell Mol Med,2008,12(4)：1374

[10]金红芳,杜军保,唐朝枢.“废气不废”：气体信号分子硫化氢的研究进展.生理学报,2010,62(6)：495