吴玉红，白丽霞，杨 虹

（北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳 518036）

随着喹诺酮类和氨基糖甙类两种药物在临床上的广泛应用，两者的耐药性也在逐渐上升。细菌对喹诺酮类药物的耐药研究，国内外早期的研究主要集中于染色体介导［1］的喹诺酮耐药机制，而近年来，质粒介导的喹诺酮类耐药备受关注，尤其是最近发现的能使氨基糖甙类药物和氟喹诺酮类药物同时失活的氨基糖甙乙酰转移酶的变异基因aac（6’）－Ibcr，该基因编码的灭活酶可使环丙沙星及诺氟沙星中的氨基氮发生乙酰化，从而使其抗菌活性下降。研究显示该基因可使细菌对环丙沙星及诺氟沙星的最小抑菌浓度（MIC值）上升4倍［2］。本研究了解我院2011年临床常见的革兰阴性杆菌的耐药状况及其质粒介导的能使喹诺酮类和氨基糖甙类药物同时耐药的基因aac（6’）－Ib－cr的流行分布状况，从而比较分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌种中的分布差异。目前国内对aac（6’）－Ib－cr基因研究甚少，而且尚无该基因在不同菌属间分布差异的相关研究报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 本研究收集2010年从临床分离的299株非重复的临床常见的革兰阴性杆菌，其中53株鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanni，Aba）、66株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pae）、83株大肠埃希菌（Escherichia coli，Eco）和97株肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kpn）。

1.1.2 主要试剂 培养基为分离培养用培养基（Columbia基础＋5 ml／dl脱脂羊血）；细菌鉴定和药敏试剂为MicroScan；Taq DNA Polymerase聚合酶及PCR相关材料购自Fermentas生物工程公司；引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司（Invitrogen Trading（shanghai）Co，Ltd）合成。

1.1.3 主要仪器 全自动细菌鉴定及药敏分析仪为美国 MicroScan Walk Away 40；BIO－RAD（美国）公司生产的C1000TMThermalCycler PCR仪；Eppendorf（德国）生产的Centrifuge 5417R台式冷冻离心机；BIO－RAD（美国）生产的 Power Pac Basic PowePac HC电泳仪；BIO－RAD（美国）生产的 Gel Doc XR＋凝胶成像及分析系统。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及其MIC值的测定：用全自动细菌鉴定及药敏分析仪MicroScan Walk Away 40进行细菌鉴定和药敏试验（MIC值），并严格按照CLSI标准判断药敏结果。质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。

1.2.2 PCR模板的提取：煮沸法提取细菌基因组DNA。将细菌接种于LB平板上，37℃培养箱培养过夜，次日选单个菌落于LB平板分纯，37℃培养。第三天挑取数个菌落入盛有180μl的双蒸水（DDH2O）EP管中，煮沸10 min，13 000 r／min离心3 min。取上清液即细菌DNA模板于EP管，在－20℃保存备用。

1.2.3 基因aac（6’）－Ib的 PCR 筛选及aac（6’）－Ib－cr的确定：采用PCR检测所有菌株的质粒介导耐药基因aac（6’）－Ib；并以内切酶BtsCI酶切消化aac（6’）－Ib的PCR阳性产物以确定aac（6’）－Ib－cr。

aac（6’）－Ib引物设计参照文献［3］，上游引物5’－TTGCGATGCTCTATGAGT－GGCTA－3’和 下 游引物5’－CTCGAATGCCTGGCGTGTTT－3’，产物482 bp。反应条件：94℃变性45 S，55℃退火45 S，72℃延伸45 S，34个循环。PCR产物5μl上样，1.5 g／dl琼脂糖凝胶中电泳1.0 h，电压100 V，Gel Red染色，用凝胶成像系统观察并扫描成像。

基因 aac（6’）－Ib－cr确定：用内切酶法从 aac（6’）－Ib的 PCR 阳性产物中检测。用 BtsCI（New England Biolabs，Beverly，Mass）对aac（6’）－Ib阳性PCR产物进行酶切消化实验。由于aac（6’）－Ib－cr缺乏内切酶BtsCI的酶切位点，而野生型具有此酶切位点。将酶切产物进行电泳后，两条带的为aac（6’）－Ib－cr阴性株即为aac（6’）－Ib；不能被酶切即只有一条带者为aac（6’）－Ib－cr阳性株［3］。

1.2.4 统计学分析：采用SPSS11.0软件进行统计学分析，比较分析aac（6’）－Ib－cr基因在不同菌种中的分布差异。比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细菌的耐药情况 在上述4种菌株中，氨苄西林耐药率最高，达75.3%，其次是头孢唑林，耐药率为58.5%；环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为25.1%和16.7%；哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星和亚胺培南的敏感率均在90%以上。具体耐药情况见表1。

2.2 基因aac（6’）－Ib和aac（6’）－Ib－cr的阳性率共检出aac（6’）－Ib基因29株，其中鲍曼不动杆菌5株，大肠埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在铜绿假单胞菌中未检出aac（6’）－Ib。有21株变异为aac（6’）－Ib－cr，变异率为72.4%（21／29）；aac（6’）－Ib－cr的总阳性率为7.0% （21／299），其中大肠埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其阳性率为11.67%（21／180），而在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中未检出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。经χ2检验，两者间的差异具有统计学意义（χ2＝14.932，P＜0.01）。

表1 299株临床常见的革兰阴性菌耐药情况（%）

3 讨论

随着抗生素在临床上的广泛应用，细菌耐药率也在不断翻番。本研究在来自临床299株常见的革兰阴性杆菌中，氨苄西林耐药率已高达75.3%，头孢唑林的耐药率为58.5%，复方新诺明的耐药也接近50%，这说明曾经是抗感染的前线药物，已经被细菌的反抗打垮了。但是这也催生了新药的陆续出现，在抗感染的任务中，头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南等耐药率在20%左右的抗菌药可以发挥中间力量的作用。最后，拿出目前大家都公认的一线药如亚胺培南、哌拉西林／他唑巴坦、阿米卡星等，在本研究中它们的敏感率都超过了90%。当然，最近还出现了如头孢哌酮／舒巴坦、替加环素等新药，针对耐碳青霉烯类药物的细菌发挥着重要作用。纵使这样，临床医生一样要慎用抗生素，为抑制超级细菌的出现作出应有的贡献；而且刻不容缓，因为已有研究报道［4］在ICU，鲍曼不动杆菌除了亚胺培南外，对其他如哌拉西林／他唑巴坦、头孢吡肟、头孢哌酮／舒巴坦、阿米卡星、左旋氧氟沙星等13种抗菌药物的耐药率均超过50%。

在本研究中，环丙沙星的耐药率较高，达到了25.1%，要慎选，而左氧氟沙星耐药率相对低一些（16.7%），可优先于环丙沙星选用；对于氨基糖甙类药物，尽管阿米卡星耐药率在5%以下，但是庆大霉素和妥布霉素耐药率却分别达到了19.7%和13.7%。因此，喹诺酮类和氨基糖甙类的抗菌活性也不容乐观，细菌对其耐药的机制研究也在不断升温。就aac（6’）－Ib－cr而言，它是世界上首次发现的能同时导致氨基糖甙类和喹诺酮类两种药物失活的一种酶［2］，而且还能提高暴露于环丙沙星的菌株发生染色体突变的几率。另外，此研究还发现aac（6’）－Ib－cr是通过对喹诺酮类药物哌嗪环上氨基氮原子的乙酰化作用而使环丙沙星失活而介导低水平耐药，而对左氧氟沙星、莫西沙星等其它的喹诺酮类抗生素并不起作用（在结构上这些药物合成时哌嗪环的氨基已被甲基取代），这种现象可以在一定程度上说明细菌为适应外界环境而发生了进化。甚至会不会出现能让3种或3种以上的抗菌药物耐药的基因，这都是一种可怕而又可能的猜测。

在检出aac（6’）－Ib基因29株中，鲍曼不动杆菌仅占5株，大肠埃希菌11株，肺炎克雷伯菌13株；在铜绿假单胞菌中未检出aac（6’）－Ib。也就是说肠杆菌科细菌占了82.8%（24／29），而非发酵菌仅占17.2%。同时有21株aac（6’）－Ib基因变异为 aac（6’）－Ib－cr，变异率为72.4%（21／29）；为什么 aac（6’）－Ib基因的变异率会如此高呢？这值得再深入研究。aac（6’）－Ib－cr的 总 阳 性 率 为 7.0% （21／299），其中大肠埃希菌有9株及肺炎克雷伯菌有22株，其阳性率为11.67%（21／180），而在鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌中未检出aac（6’）－Ib－cr（0.0%，0／119）。经χ2检验，两者间的差异具有统计学意义（P＜0.01）。为什么aac（6’）－Ib－cr在肠杆菌科细菌和非发酵细菌中的分布差异具有统计学意义，也许还需要进行大量研究，可能aac（6’）－Ib－cr基因还有更多的生物学价值有待发现。

［1］Hooper DC.Mechanisms of action and resistance of older and newer fluoroquinolones［J］.Clin Infect Dis，2000，31（suppl 2）：24.

［2］Robicsek A，Strahilevitz J，Jacoby GA，et al.Fluoroquinolone modifying enzyme：a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase［J］.Nat Med，2006，12：83.

［3］Park CH，Robicsek A，Jacoby GA，et al.Prevalence in the United States of aac（6’）－Ib－cr encoding a ciprofloxacin－modifying enzyme［J］.Antimicrob Agents Chemother，2006，9（11）：3953.

［4］詹銮峰，高 鹏.关于ICU病房鲍曼不动杆菌耐药性及基因型研究［J］.中国实验诊断学，2011，15（7）：1137.