邓莉俐 王仁君 综述 苏纪平 审校

1 广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科(南宁 530021)

水杨酸盐是临床上常用的解热、镇痛、抗炎、抗风湿药物，但其对听觉系统的副作用如可导致耳鸣、可逆性的30～40 dB的听力下降等仍是临床上亟待解决的问题。研究已发现，水杨酸钠的耳毒性机制与谷氨酸受体N-甲基-D-天冬氨酸(N-metlyl-d-aspartate,NMDA)介导的兴奋毒性有关，并且能通过内源性Src激酶家族调节。本文就水杨酸钠的耳蜗兴奋毒性及其与Src的关系进行综述。

1 水杨酸钠的兴奋毒性

谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统一种主要的兴奋性神经递质，但由于各种生理或病理原因造成谷氨酸浓度过高，过度刺激其突触后受体，则会产生细胞毒性，即兴奋毒性。过高浓度的谷氨酸激活PA/KA受体，促进大量Na+、Cl-和水内流进入细胞，致细胞肿胀[1]；同时，过量的谷氨酸过度激活NMDA受体，致Ca2+通道病理性开放，引起大量Ca2+内流，细胞内Ca2+超载，线粒体功能失活，自由基产生以及ATP能量衰竭，Caspase酶级联反应激活，细胞凋亡[2]。临床上，这种兴奋毒性所造成的细胞损伤很常见，如急性的局部缺血、脑外伤时,兴奋毒性直接介导神经细胞的丢失；在慢性神经退行性疾病(如老年性痴呆、肌萎缩型侧索硬化、帕金森病、亨廷顿病等)中,兴奋毒性也介导了神经机能异常。

水杨酸钠是阿司匹林的主要代谢产物和有效成分，广泛应用于解热、镇痛、抗炎、抗风湿和抗血栓形成等多方面临床治疗。但在神经系统，水杨酸钠对不同状态下的神经元作用迥异，既有神经保护作用，亦有神经毒性作用。

实验证明，在许多情况下，水杨酸类药物对神经细胞有良好的神经保护作用。Wang等[3]报道，在酸中毒的大脑皮层神经元模型中，用膜片钳全细胞记录模式，可以检测到300 μM到30 mM的水杨酸钠或阿司匹林通过作用于酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)，能可逆性抑制ASIC电流，显著减少酸中毒引起的皮层神经元死亡数量，从而使大脑皮层细胞免受损伤。在原代培养的中脑组织中，用免疫组化染色的方法也可以观察到0.01～1 mM阿司匹林能明显抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LP)诱导的神经毒性，通过检测观察到阿司匹林主要抑制了LP诱导的氧化应激和/或炎症反应，减少活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，同时促进抗炎细胞因子白介素-10(interleukin,IL-10) 和转化生长因子 1(transforming growth factorbeta-1,TGF- β 1)的释放，从而保护多巴胺能神经元免受LP引起的神经毒性损害[4]。此外，在NMDA造成视网膜神经节细胞兴奋毒性的模型中，阿司匹林还能通过直接抑制蛋白激酶Cζ(protein kinase C zeta,PKCζ)自身裂解或在细胞核中易位而阻止其被活化，减少诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)及一氧化氮(nitric oxide,NO)的表达,使视网膜细胞免受损伤, 发挥神经保护作用[5]。另一方面， Katz 等[6]却报道给大鼠腹腔注射1 700 mg/kg水杨酸钠40分钟内可致死大鼠，而抑制水杨酸钠导致的线粒体膜通透性转换(membrane permeability transition，MPT)，能明显延长注射致死剂量水杨酸钠的大鼠的生存时间。在PC12细胞株和大鼠耳蜗器官的培养中,水杨酸钠也诱导了神经细胞凋亡并呈现浓度依赖性[7，8]。为探讨水杨酸钠对中枢神经系统毒副作用的机理，Gong等[9]应用膜片钳技术，观察水杨酸钠对海马CA1区兴奋性突触后电位(eld excitatory postsynaptic potentials,field EPSPs，fEPSPs)和细胞群体峰电位(population spike ，PS)的影响时发现，水杨酸钠明显增强PS的峰值，却对fEPSPs没有明显的影响，进一步观察发现水杨酸钠通过抑制γ-氨基丁酸(γ-aminobutvric acid,GABA)能神经传递增强了神经兴奋性，但对基本的兴奋性神经突触传递并无影响。

以上实验结果提示，水杨酸钠作用机制的复杂性和多样性导致了水杨酸钠的不同作用表现。实验模型、药物剂量、处理时间以及体温、营养等多方面因素都能影响水杨酸钠作用结果的变化。水杨酸钠对神经细胞的保护作用是主要针对缺血、缺氧、酸中毒等病理条件而言的，主要通过抗氧化、抗炎机理，抑制NF-κB的活化等机制来实现。而水杨酸钠的细胞毒性作用机制则是其自身毒性对正常细胞的损伤而言，其机制与其经典的药物作用机制不同，既可以直接诱导MPT，产生氧化磷酸化脱偶联，直接促使细胞凋亡，也可通过阻断抑制性受体功能，造成兴奋性受体过度兴奋，产生兴奋毒性。

2 水杨酸钠与耳蜗螺旋神经节神经元的凋亡

谷氨酸是耳蜗内毛细胞与耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neurons，SGN)突触的重要神经递质。谷氨酸受体广泛分布于哺乳动物的听觉系统，如N-甲基-D天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptor,NMDAR)、α-氨基-3羟基-5甲基-4异恶唑受体(al-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate receptor,AMPAR)、海人藻酸受体(kainate，KAR)在耳蜗中均有表达。

损伤性噪声、耳蜗缺血、外伤等都可引起谷氨酸从内毛细胞过度释放，导致SGN兴奋性毒性,表现为SGN神经元的肿胀(空泡化)以及内毛细胞附近树突末梢的空泡形成，最后神经细胞凋亡[10，11]。直接将体外培养的SGN暴露于高浓度的谷氨酸盐中，亦能诱导SGN凋亡，并呈浓度依赖性，而应用caspase-3阻断剂能对抗谷氨酸盐引起的SGN凋亡[12]。

Guitton等[13]在水杨酸钠诱导的耳鸣大鼠模型中，通过圆窗在耳蜗外淋巴液中给予NMDA受体阻断剂5-甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸(dizocilpine maleate,MK-801)、7-氯犬尿酸(7-chlorokynurenic acid,7-CK)、加环利定(gacyclidine)后，观察到大鼠的耳鸣明显减弱，证明水杨酸钠引起的耳鸣与耳蜗的NMDA受体有关，是水杨酸钠兴奋毒性的表现。迄今为止，已有许多关于水杨酸类药物对听觉系统的毒副作用的研究，大多认为水杨酸钠的作用机制是个复杂的过程，大剂量的水杨酸类药物损伤神经功能可以沿着听觉通路，从毛细胞和初级听觉神经元(SGN)到大脑中枢听觉皮层的任一环节起作用[14～17]。毛细胞和SGN作为这个反应的外周环节，起着重要作用。但较毛细胞而言，SGN对水杨酸盐的毒性更敏感。体内外实验都已证明，1 mM的水杨酸盐即可引起显著的SGN毒性[18]，而毛细胞则需要5～7 mM甚至更高的浓度[19],最近甚至有报道高浓度的水杨酸钠损伤SGN，却能增强毛细胞的功能[20]。尽管文献报道水杨酸盐对多种神经细胞有保护作用[2～4]，但用水杨酸钠直接作用于体内或体外培养的SGN组织时，却观察到水杨酸药物促进了SGN的凋亡，并呈现出时间和剂量的依赖趋势[8, 18, 21，22]。其具体机制目前并没有完全明了。Jung等[8]用水杨酸钠作用于SGN后，检测到其细胞活性明显降低,利用荧光染色标记出其凋亡率明显增高，SGN细胞上多种热休克蛋白以及Bcl-2的表达发生了改变，为水杨酸钠的神经毒性作用提供了一部分病理依据。Wei等[18]亦观察到水杨酸钠作用后SGN呈现胞体萎缩、轴突缩短甚至消失的典型凋亡形态学改变，SGN上多种与凋亡相关的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)也发生了改变，推测水杨酸钠所引起的SGN凋亡与caspase介导的凋亡通路有关。Feng[21，22]则用免疫组化方法验证了水杨酸钠诱导的SGN凋亡与caspase-3有关，水杨酸钠对SGN的兴奋毒性作用是通过caspase依赖性的凋亡通路实现的。

3 Src家族与水杨酸盐的兴奋毒性

3.1 Src家族的结构及功能 Src家族是一组膜结合的非受体型蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK),现已知Src家族包括Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn、Hck、Fgr、Blk、Frk亚科9个成员，它们的表达有组织特异性，其中Src、Lck、Fyn、Yes、Lyn在中枢系统中均有高表达。Src家族成员的结构特征是N端的豆蔻酰化、一个不同源的独特结构域、两个调节结构域(SH2和SH3)、一个保守的催化结构域(又称激酶结构域，kinase domain,KD)和C端负调控区域。Src家族通过信号转导作用，参与调节细胞生长、分化、继续生存以及神经细胞的突触传递等功能，并且能影响细胞粘附、迁移和入侵的能力[23]。

3.2 Src家族对兴奋毒性的调节作用 兴奋毒性在细胞缺氧、外伤等病理过程中发挥着重要作用，其主要机制由NMDA受体介导。在中枢神经系统中，Src家族的一个重要作用是调节各种离子通道的活动，如电压门控性钾离子通道[24]、钙离子通道[25]、烟碱乙酰胆碱受体[26]等。 Src对NMDA受体也有明显的调控作用，主要有以下几个方面：①介导兴奋毒性：XU等在大鼠大脑外伤后的病理过程中观察到，Src通过对突触后密度-95(postsynaptic density-95,PSD-95)酪氨酸磷酸化介导了兴奋毒性损伤机制的启动和增强[27]。Xu等[27]也在缺血再灌注的大鼠模型中通过激活GluR5受体使Src酪氨酸磷酸化功能下降，并影响其与PSD-95、NR2A的相互作用，进而使NMDA受体的活性下降，兴奋毒性减弱；②调节突触和突触可塑性：在小脑颗粒细胞突触形成过程中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体F1K1与NMDA受体亚基NR1和NR2B组成复合体。VEGF与F1K1结合时，通过激活Src激酶家族而使复合体中NR2B磷酸化增强，NMDA 受体电流和Ca2+内流(Ca2+influx)增大，这种增大的Ca2+内流能促进小脑颗粒细胞迁移，对神经细胞的突触形成起重要作用[28]；③易化痛觉感受：在用鞘内注射NMDA构建的痛觉过敏的大鼠模型上，鞘内注射Src激酶抑制剂PP2能阻止NR2B受体亚基的酪氨磷酸化，减弱NMDA诱导的NR2B受体突触表达，使大鼠的机械触感的敏感性下降，痛觉敏感性降低[29]；④介导药物成瘾：在可卡因成瘾的小鼠模型中，Src激酶诱导的NMDA受体亚单位NR2B酪氨酸磷酸化，促进了细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK) 激活，导致了可卡因成瘾的发生[30]。

Src激酶家族调控NMDA受体的主要证据有：①Src家族通过SH2和SH3区域与NMDA受体结合，应用联合免疫沉淀法可标志出Src是NMDA受体蛋白的组成部分，并集中在突触后密度处(postsynaptic density，PSD)[26]；②Src家族激活后，能促使NR2A、NR2B磷酸化，增强NMDA 受体功能。用抗磷酸化抗体标记NR2A和NR2B受体发现，活体大鼠海马细胞中约有2.1%NR2A受体亚基和3.6%NR2B受体亚基是被酪氨酸磷酸化的。在NR2A受体亚基中，已发现多个c-Src的磷酸化作用位点：Tyr-1292、Tyr-1325和Tyr-1387。 Src通过这些作用位点使受体亚基酪氨酸磷酸化，阻止Zn2+依赖性抑制作用对NMDA受体的抑制作用，增加NMDA受体的活性而上调NMDA受体功能[31]；③应用细胞电生理技术，在细胞中添加Src或能激活Src家族成员的相关肽，能增强NMDA受体单通道活动，提高NMDA诱导的电流和NMDA受体参与组成的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)；这种增强了的NMDA受体活动能被特异性Src阻断剂阻断[32]。

研究表明，NMDA受体电流调控由酪氨酸磷酸化和去磷酸化来保持平衡：抑制内源性Src活动或添加外源性的蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase，PTP)能抑制NMDA受体功能[33]；反之，应用PTP抑制剂抑制内源性的PTP活动或添加外源性Src，能增强NMDA受体功能[34]。

根据以上实验结果，推测Src家族对兴奋毒性的调节机制可能有:①Src 家族是NMDA受体蛋白的组成部分;②Src 调控NMDA受体的磷酸化。

3.3 Src家族与水杨酸钠 在非神经细胞中观察到了水杨酸钠能抑制Src活性[35，36]。Wang等[35]用免疫沉淀和免疫印迹法在体外培养的心肌中观察到水杨酸钠能抑制血管紧张素或血小板衍生生长因子激活c-Src。应用细胞内Ca2+螯合剂或蛋白激酶C抑制剂能减弱水杨酸钠对Src磷酸化的抑制作用，表明水杨酸钠对Src活性的抑制作用机制是Ca2+和蛋白激酶C依赖性的。同时，实验还发现水杨酸钠对Src活性的抑制作用在浓度为5～20 mM时最明显，并呈现出浓度依赖性，即水杨酸钠浓度越高其对Src磷酸化的抑制作用越强。而 Perez等[36]发现在单核细胞中，水杨酸钠只有在20 mM的浓度时才对Src磷酸化起一定的作用，而低于这个浓度是没有作用的。但在神经细胞的研究中，仍未见水杨酸钠与Src的关系的报道。

4 结语

磷酸化对NMDA受体的调控是一系列影响因子作用的结果，在兴奋毒性过程中起关键作用，通过调节NMDA受体磷酸化，尤其是通过调节Src功能而减少兴奋毒性的危害将是神经科学领域研究的一个新的切入点。目前，Src对于水杨酸钠耳毒性是否具有调节作用仍未见报道，如何通过调节其自身受体磷酸化状态来影响兴奋毒性过程而达到保护神经细胞是目前亟需进一步研究的课题,以期为防治许多内耳疾病提供新的理论依据。

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