张连升，梁 永，崔飞伦

(1兴化市人民医院，江苏兴化225700;2兖州市九一医院;3江苏大学附属人民医院)

前列腺癌(PCa)在欧美地区发病率较其他国家或地区高，占欧美男性癌症的第2位，是发达国家导致男性死亡的主要威胁之一［1］。腺瘤样结肠息肉易感基因(APC基因)编码的APC蛋白是个多功能抑制肿瘤的蛋白家族，直接参与Wnt信号传导途径，还参与细胞骨架两种主要成分微丝和微管的调节。2011年10月～2012年3月，我们检测了60例前列腺癌患者APC基因启动子区CpG甲基化情况，观察其APC基因启动子区CpG甲基化率的变化，分析环境危险因素的作用，探索预防和早期诊断PCa的思路和方法。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2007年10月～2011年9月江苏大学附属人民医院收治的60例新发PCa患者为PCa组，年龄61～86(75.85±6.79)岁，均经临床病理证实。Gleason评分4～7分者56例，8～10分者4例。另取40例良性前列腺增生(BPH)患者为BPH组，年龄64～84岁。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 由统一的调查员，利用统一的调查表，按照规定内容采用面试方式进行调查，逐一询问并如实填写，所有内容均获得调查者的同意。收集的环境危险因素包括体质量指数(BMI)、饮酒、喝茶、吸烟、体育运动等。饮酒定义为每周至少1次并持续6个月以上;不饮茶为饮茶次数＜4次/周，否则为饮茶;吸烟分为不吸、适度吸烟(≤20支/d)、重度吸烟(＞20支/d)三类;运动时间超过30 min为运动1次，不运动为运动频率＜4次/周，否则为运动。

1.2.2 APC基因启动子区CpG甲基化的检测 采用亚硫酸盐修饰后测序法检测。①样本处理及提取DNA:切取两组患者PCa或BPH组织石蜡标本，用10%甲醛固定，用DNA提取试剂盒操作流程提取DNA。DNA提取量一般40～120 ng/μL，紫外分光光度计测定峰值260 nm，DNA无RNA和蛋白污染。②亚硫酸氢盐修饰DNA:用EZ DNA Methylation-Gold TMKit DNA(ZYMO RESEARCH)试剂盒严格按照步骤处理，修饰DNA。③引物设计:用Primer5.0软件进行设计APC基因引物设计。APC上游引物5'-GGGGTTAGGGTTAGGTAGGTTG-3'，下游引物5'-AACACCTCCATTCTATCTCCAATAA-3'，M13-47引物5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'。选APC基因转录起始位点上游1 000 bp至第一外显子区富含CG位点密集的基因区824～1 054为研究序列，基因长度231 bp，其中包含13个CG位点。④PCR:反应体积50 μL，其中Hot Start Version Taq 0.5 μL，引物各1 μL，dNTP 4 μL，修饰后的DNA 8 μL，余下以ddH2O补齐，所有反应皆用ddH2O作为对照。PCR反应参数:94℃ 2 min 40 s，94℃ 30 s，57℃30 s，72℃ 40 s，37个循环;72℃ 5 min。APC基因产物片段为231 bp。PCR反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳，随机选取10%标本进行重复实验。⑤PCR产物纯化回收:PCR产物经Axy Prep PCR清洁试剂盒纯化回收后备基因克隆用。⑥目的基因克隆:分别从PCa组和BPH组随机选取3个DNA样本进行同组混合。混合后DNA用于基因克隆测序。实验步骤为:pMD18-TVector载体1 μL，PCR产物1 μL，SolutionⅠ5 μL，ddH2O补至10 μL，混均后16℃反应90 min，全量(10 μL)加入100 μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30 mim，42℃加热60 s后，迅速再次冰浴2 min，加入890 μL的SOC培养(无氨苄西林)，37℃下220 r/min震荡，培养120 min，全速离心后弃去上清液，涂布于LB琼脂平板(含氨苄西林100 μg/mL)上培养，37℃培养箱过夜。⑦PCR鉴定克隆及测序:从克隆后菌落中各挑选10个白色孤立克隆，置入200 μL LB液体培养基中摇菌3 h后PCR鉴定。PCR反应体系:鉴定引物RV-M 1 μL，M13-47 1μL，TaqPCR Master Mix 12.5 μL，模板(菌液)1 μL，ddH2O补至25 μL。PCR反应参数:94℃3 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30个循环;72℃5 min。PCR产物经2% 琼脂糖凝胶电泳，鉴定APC基因大小382 bp(目的基因230 +载体区152 bp)。鉴定合格后隆送公司(上海迈浦生物科技有限公司)测序。

1.2.3 统计学方法 采用双录入的方式将实验室检测和流行病学调查资料录入计算机。采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，组间比较采用χ2检验及精确概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCa发病的环境危险因素 PCa发生的环境因素分析表明，PCa发病与饮酒、饮茶有关，其相对危险度的比值比(OR)分别为:2.46(95%CI为1.02～5.91)、0.29(95%CI为0.12～0.67);PCa发病与患者年龄、BMI、吸烟、运动无关。

2.2 APC基因启动子区CpG甲基化程度 PCa组测序780个CG位点，381个(48.84%)有甲基化;对照组测序520个CG位点，6个有甲基化。PCa组APC基因启动子区CpG甲基化率明显高于对照组(P＜0.05)。

2.3 APC基因启动子区CpG甲基化与PCa临床病理参数的关系 见表1。由表1可见，PCa组APC基因启动子区CpG甲基化与血清前列腺特异性抗原(PSA)水平、Gleason评分、TNM分期有关(P均＜0.05)。

3 讨论

到目前为止，PCa的病因及致病机制仍不十分清楚。Lichtenstein等［2］研究表明，42%的PCa患者的发病可归因于遗传因素，其他的则与环境因素相关。

表1 PCa组APC基因启动子区CpG甲基化与临床病理参数的关系

根据2000年国际肥胖特别工作组提出的亚洲成人体质量分级标准，BMI 18.5～22.9为正常，23～24.9为超重，＞25为肥胖;男性腰围＞90 cm，女性腰围＞80 cm，亦属于中心性肥胖(腹型)。研究认为，高BMI与PCa风险增加有关［3］。由于肥胖者细胞内线粒体的脂质代谢能力下降，导致氧化损伤物质积聚，为肿瘤的发生提供了条件［4］。而本研究进行因素分析时BMI与PCa的关联并没有显著意义。

生活行为方式中饮酒因素是目前的研究热点之一。酒精可以改变体内雄激素和雌激素的平衡，从而影响激素依赖型肿瘤如PCa。有研究报道［5］饮酒量与PCa有关联:随着饮酒量的增加，患PCa的危险性升高。但也有研究表明饮酒与PCa发病无关联［6］。此外酒的种类与PCa发病有无关联也没有明确结论。我们的调查显示饮酒与PCa发生有显著的关系，饮酒者患PCa的风险是不饮酒者的2.46倍。吸烟不仅是引起肺癌的直接原因之一，也使患PCa的相对危险度增加到 1.5～2.0，并有可能使PCa向恶性程度更高的类型转化［7］。国外有研究认为，年轻时过多的吸烟将增加 PCa的患病可能性［8］。但是本研究结果显示吸烟与PCa的关联并没有统计学意义。绿茶中含有茶多酚类物质，能够引起癌细胞的死亡，从而发挥抗癌功效。Henning等［9］的研究首次在人体中证实口服茶多酚后患者前列腺组织中的多酚类物质浓度较对照组显著增高。尽管血清中无法检测到多酚类物质，但是用含口服茶多酚后患者血清的培养液可以在体外显著抑制PCa细胞增殖。然而Choan等［10］在一项Ⅱ期临床试验中给予19例难治性PCa患者250 mg绿茶提取物2次/d口服，疗程至少持续2个月，然后复查PSA或进行影像学检查，结果显示绿茶提取物并无积极治疗效果。2001～2002年，一项旨在调查绿茶是否与PCa有病因学关系的病例对照研究［11］在中国杭州进行，结果发现饮茶量与PCa有关，绿茶对PCa具有保护性。其原因是绿茶中含有抗氧化剂。本研究发现饮茶者患PCa的危险性是不饮茶者的0.29倍，与文献相符。

Wnt信号传导通路的异常激活与人类肿瘤的发生发展密切相关。APC基因是Wnt信号的下游抑制因子，APC基因的失活后则会导致β-catenin降解减少，β-catenin从胞质中转移到细胞核中与Tcf-4相结合，活化靶基因刺激肿瘤生长［12］。研究证明在结肠癌等消化道肿瘤中APC基因启动子甲基化率很高［13］，而在PCa中APC基因甲基化状况国内外相关报道较少。

亚硫酸盐修饰后测序法是目前公认的研究基因甲基化的金标准［14］。本研究采用此方法，研究结果显示PCa组和BPH组CG位点甲基化发生率分别为48.84%、1.19%，PCa组高于BPH组。表明APC基因启动子区CpG甲基化的发生与PCa的发生及临床病理参数相关联。由于样本量较小，本研究的结果仍需扩大样本进一步验证，同时可以结合蛋白组学进一步探讨该目的基因在PCa发生、发展中的作用。

一些研究表明，DNA甲基转移酶能减少阻断细胞分化或抑制肿瘤形成［15］。另外，DNA甲基转移酶基因在体外实验中具有抗肿瘤活性，并且能在一定程度上逆转恶性表型［16］。

本研究发现，APC基因CpG位点甲基化率及环境因素如饮茶和饮酒在PCa的发生及发展中起着一定的作用。APC基因CpG位点甲基化率与饮茶、饮酒之间在PCa的发病中存在拮抗作用。环境危险因素与PCa的发生产生影响，有关环境因素、表观遗传因素与PCa发病之间的关系仍需进一步扩大样本进行更加深入的研究，以揭示其间的关系。

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