李健 迭敏 周英 吕文彬

WADiana全自动配血系统进行献血者Rh(D)阴性确认试验方法的建立*

李健①迭敏①周英①吕文彬①

目的：建立一种运用全自动微柱凝胶技术进行献血者Rh(D)阴性确认试验的方法。方法：采用西班牙Grifols公司WADiana全自动配血系统编制试验程序，通过全自动加样以及孵育、离心等步骤进行献血者Rh(D)阴性确认试验。结果：根据试验需要，编制出两种加样程序，可以进行Rh(D)阴性确认和Rh(D)阴性确认+抗体筛选两种试验，通过20份已知Rh(D)血型鉴定和抗体筛选结果的标本，同时进行全自动微柱凝胶法以及试管法检测，两种方法检测结果均一致。结论：利用WADiana全自动配血系统，可以采用全自动微柱凝胶技术进行Rh(D)阴性稀有血型确认试验，提高实验的自动化程度，确保实验过程更标准化，实验结果判读更加客观，并且可以通过微柱凝胶卡图像拍摄达到实验结果的保存信息化。

微柱凝胶技术； WADiana全自动配血系统； 献血者； Rh(D)阴性确认试验

Rh(D)阴性确认试验是献血者Rh血型鉴定中的重要试验。通过该试验可以检出经IgM型抗-D试剂鉴定为阴性，但是用多个批次或厂家的IgM+IgG型或IgG型抗-D试剂进行间接抗球蛋白试验鉴定出现部分或全部结果阳性的献血者，这部分献血者即为Rh(D)变异型，这种血液临床应作为Rh(D)阳性血使用。

目前采供血机构进行献血者Rh(D)阴性确认时，基本都采用试管法间接抗人球蛋白试验，该方法加样、孵育、生理盐水洗涤、离心等步骤均为手工操作，最后由实验操作者肉眼判读结果，且实验结果无法保存。微柱凝胶技术(MGIA)是1990年开始应用于红细胞血型血清学临床检验的，在经典抗人球蛋白试验基础上发展起来的新型检测方法，在国外已成为常用红细胞血型血清学检测技术[1]，本实验室根据微柱凝胶技术的优势，结合WADiana全自动配血系统的功能和特点，建立了全自动微柱凝胶技术进行献血者Rh(D)阴性确认试验的方法，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 仪器 西班牙Grifols公司WADiana全自动配血系统。

1.2 试剂 单克隆IgM+IgG抗-D抗体分别购自德国Biotes公司、加拿大Dominion公司、法国Diagast公司、英国Millipore公司(分别以 D1、D2、D3、D4表示)，IgG 抗 -D抗体(以D5表示)、抗人球蛋白试剂和抗体筛选细胞均购自上海血液生物医药有限公司，抗球蛋白微柱凝胶卡购自西班牙Grifols公司。

1.3 试验方法编制和设计 根据Rh(D)阴性确认试验的特点，其实质是间接抗人球蛋白试验，试验过程中孵育和离心的参数均与该仪器其他间接抗人球蛋白试验(如交叉配血、抗体筛选)相同，仅仅是加样的差异。Rh(D)阴性确认试验是采用多个抗-D试剂检测待检者红细胞上是否有D抗原。由于Rh(D)阴性献血者通常受免疫刺激产生ABO以外抗体的几率比Rh(D)阳性献血者高[2-3]，因此通常在进行献血者Rh(D)阴性确认试验的同时，也对其进行抗体筛选试验，以避免含有ABO以外抗体的血液产品发放到临床使用。

在加样程序设计中，待检者红细胞均为仪器吸取全血标本管中压积红细胞自动稀释为浓度0.8%、加样50 ul，筛选细胞为已配置好0.8%浓度、加样50 ul，待检者血浆和抗-D试剂加样量均为25 ul。编辑Rh(D)阴性确认(Rh Neg)和Rh(D)阴性确认+抗体筛选(Rh Neg+Anti Scr)这两个试验程序，以满足不同试验要求所需。具体流程为：

1.3.1 Rh Neg每个待检者检测需要5孔微柱凝胶孔，加样时分别在五孔中均先加好各自对应待检者红细胞，在每个待检者的第1孔中加入D1→第2孔中加入D2→……→第5孔中加入D5，加样结束即进入孵育、离心、结果判读。

1.3.2 Rh Neg+Anti Scr 试验每个待检者需要8孔，每个标本检测需要一张完整WADiana微柱凝胶抗人球卡。加样依次为每张卡前三孔依次加入抗体筛选Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ细胞→每个待检者血浆分别加入对应卡的这三孔→待检者红细胞加入对应卡的后五孔→每张卡后面五孔依次加上D1、D2、D3、D4、D5，加样结束即进入孵育、离心、结果判读。

以上两个试验，针对Rh(D)结果判读规则均设置为D1、D2、D3、D4、D5全阴性，该献血者定为Rh(D)阴性，若其中任一试剂或一个以上试剂为阳性结果，该献血者则定为Rh(D)阳性。在Rh Neg+Anti Scr中，若抗体筛选Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ孔出现1个或者1个以上阳性，表示该献血者抗体筛选试验阳性，应进一步复查，以确定其阳性结果由献血者标本抗凝效果所致或是献血者血浆中含有ABO以外抗体。

试验方法编辑完成后，用献血者标本进行模拟加样测试，将所有试剂、抗人球卡及标本放置好后，开始运行试验程序，密切观察仪器运行，加样完全按照设计流程进行，加样后按照规定时间和程序孵育、离心、结果判读，证明方法编辑正确。

2 结果

取20份已知Rh(D)血型鉴定和抗体筛选结果的标本进行检测，其结果与试管法检测结果均一致。

3 讨论

Rh血型系统是目前被国际输血协会确认的29个血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统，也是临床上仅次于ABO系统的重要血型系统。现已发现48个抗原，其中D抗原性最强，与临床输血关系最密切[4]。正常的D抗原是由10个外显子决定的至少9个抗原表位组成的嵌合体，如果缺乏或被其他基因错代了其中一种以上的因子时，称为D变异型。D变异型用普通的IgM型抗-D直接鉴定常常为阴性，但是采用不同的IgM+IgG型或IgG型抗-D进行抗球蛋白试验鉴定，则可能出现1种或1种以上的试剂结果为阳性。D变异型患者若接收了Rh(D)阳性血，可能产生抗-D抗体，因此应接收Rh(D)阴性血；但是，D变异型作为献血者，因其血液输入Rh(D)阴性患者体内，也可能刺激患者产生抗-D抗体，故该血液应作为Rh(D)阳性血发往临床使用。所以若需输血的患者Rh(D)抗原检测仅需要IgM型抗-D进行初步鉴定即可，凝集者为Rh(D)阳性，不凝集者为Rh(D)阴性；而献血者在IgM型抗-D进行初步鉴定为阴性后，进行进一步确认显得非常重要，根据《全国临床检验操作规程》要求[5]，需用3~5个不同厂家或不同批号的抗-D试剂，采用抗人球蛋白试验或酶试验，受检红细胞与各批抗-D试剂均不凝集者，才能定为Rh(D)阴性献血者。同时，由于Rh(D)阴性个体经由输血或者怀孕等免疫刺激后，产生抗体的几率远远大于Rh(D)阳性个体，因此在进行Rh(D)阴性确认实验时往往对献血者进行抗体筛选试验，以避免抗体筛选阳性的血液被发往临床引起交叉配血不合，保证临床用血的安全有效。

目前采供血机构进行Rh(D)阴性确认、抗体筛选时，普遍采用试管法间接抗球蛋白试验，该方法为手工操作，每个标本检测都需要用多只试管，需经手工加样、孵育、生理盐水反复洗涤、离心等步骤，最后由实验操作者肉眼判读结果，试验人员的工作强度大，结果判断主观性大，且实验结果无法保存，急需通过寻求自动化操作方法，减少试验过程的人为误差，降低工作人员劳动强度，确保实验过程更易标准化，实验结果判读更加客观。根据目前的技术发展，只有微柱凝胶技术(MGIA)能达到和实现上述要求。MGIA是1990年开始应用于红细胞血型血清学临床检验的，经典抗人球蛋白试验基础上发展起来的新型检测方法，在国外已成为常用红细胞血型血清学检测技术，其具有操作简便、准确、灵敏度高、特异性强、标本用量少、结果可长期保存等优点[6]。目前国内外广泛应用于血型鉴定、不规则抗体筛查、交叉配血及直接、间接抗人球蛋白试验中。

WADiana全自动血型/配血仪是由西班牙Grifols公司开发的，基于微柱凝胶技术，利用计算机自动控制操作进行血型血清学试验的自动化仪器。该仪器通常的检测程序有ABO正反定型、Rh(D)定型(IgM型试剂)、Rh表现型鉴定(C、c、E、e抗原)、抗体筛选和抗体鉴定、交叉配血，新生儿溶血病检测等，可以满足大部分的血型血清学检测需要，但并无采供血机构进行Rh(D)阴性确认试验的程序和方法。本文介绍了WADiana在献血者Rh(D)阴性稀有血型确认试验中应用的方法。采用此方法，可以同时进行Rh(D)阴性稀有血型确认试验及抗体筛选试验，提高实验的自动化程度，确保实验过程更易标准化，实验结果判读更加客观，并且可以通过微柱凝胶卡图像拍摄达到实验结果的保存信息化。该方法所得结果是否与手工试管法检测结果完全一致，能否完全替代手工试管法，还需进行大批量标本的实验检测，进行进一步的探讨。

[1] Langston M M，Proter J L，Cipolin K M，et al.Evaluation of the gel system for ABO grouping and D typing[J].Transfusion，1999，39(3):300-305.

[2] 周国平.上海市Rh阴性献血者D变异型与不规则抗体调查[J].临床检验杂志，2009，27(3):233-234.

[3] 马宏伟，谢辉.郑州市Rh阴性献血者血清学表型和不规则抗体调查[J].实用医技杂志，2007，14(3)：276-277.

[4] 朱自严.人类血型[M].北京：科学出版社，2007:232.

[5] 中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程[M].第3版.南京:东南大学出版社，2006:249-251.

[6] 浑守永，刘明霞，王玉芝.微柱凝胶技术在红细胞不规则抗体筛选中的应用[J].现代检验医学杂志，2006，21(1)：37-38.

10.3969/j.issn.1674-4985.2012.22.040

成都市卫生局2011年青年基金科研课题(编号：201135)

①成都市血液中心 四川 成都 610041

李健

2012-04-23) (本文编辑：李静)