陈方剑，宋洪杰，高鸿彬，王志君，傅 芃，陆松伟，袁文琳（第二军医大学长海医院药学部，上海200433）

感冒安颗粒是由金银花、连翘、拳参、桑叶等七味中药制成的复方制剂，具有抗病毒、抗菌等作用，属纯中药制剂，在临床上使用多年，主治感冒发热、畏寒、头痛、咽喉肿痛等及由感冒所致上呼吸道感染、急性扁桃体炎、急性咽喉炎等，疗效十分显著。至今未发现与本制剂相关的不良反应，安全性好。但其有效的物质基础尚不明确，有必要对其有效成分进行深入研究。作者采用正交设计优化感冒安颗粒中总酚酸的提取工艺，研究结果表明，该制剂中约含有11mg／g酚酸类化合物。酚酸具有抗炎、抗病毒、免疫调节、抗菌等药理作用［1］。该制剂中金银花、桑叶、拳参、连翘和紫苏等药材含有大量的酚酸类化合物，如绿原酸、异绿原酸、没食子酸、咖啡酸、1，5－二咖啡酰奎宁酸、阿魏酸等［2－7］。本研究以绿原酸、没食子酸和咖啡酸作为指标性成分对感冒安颗粒进行定量，为提高其质量标准以及进一步优化处方工艺提供参考依据。

1 材 料

1.1 仪器 岛津高效液相色谱仪（包括LC－20AD泵、SPD－M20A二极管阵列检测器、CBM－20A控制器和LC solution工作站，日本岛津公司），XS205DU电子天平（瑞士梅特勒－托利多仪器有限公司），DL－720A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）等。

1.2 药品和试剂 感冒安颗粒（第二军医大学长海医院药学部自制，批号：111025、111121、111130、120207、120214、120314、120327、120328、120329、120330），没食子酸（纯度90.1%，批号110831－200803）、绿原酸（批号110753－200413）和咖啡酸对照品（批号110885－200102）购自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为蒸馏水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈（A相）－0.4%磷酸溶液（B相），梯度洗脱：0～7.50min A相2%，7.50～7.51min A相2%→12%，7.51～25.00min A相12%；流速：0.8ml／min；柱温：室温；检测波长：没食子酸272nm、绿原酸和咖啡酸327nm；进样量：20μl。

2.2 溶液的制备 （1）对照品溶液 取在120℃干燥至恒重的没食子酸、绿原酸和咖啡酸对照品，分别精密称定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇适量，超声使溶解，放冷，定容至刻度，摇匀，分别配制成每1ml中含没食子酸108.0μg、绿原酸100.0μg和咖啡酸120.0μg的对照品溶液，备用。（2）供试品溶液 取感冒安颗粒0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加50%甲醇35ml，超声提取30min，放冷，过滤，滤液加50%甲醇溶液定容至50ml，摇匀。用0.45μm微孔滤膜滤过，精密量取续滤液0.5ml，加等量流动相稀释后混匀，即得供试品溶液。（3）阴性对照溶液 按处方比例称取除金银花、桑叶、拳参、连翘和紫苏外的各种药材适量，依照处方工艺及供试品溶液制备方法，制得阴性对照溶液。

2.3 专属性实验 按照2.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各20μl进样测定。结果表明，供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相同的保留时间上有相同的色谱峰，而阴性对照品在此处则无吸收峰，表明专属性良好，结果见图1。

图1 感冒安颗粒的HPLC谱图Figure 1 HPLC photograms of Ganmao’an granules

2.4 标准曲线的制备 分别精密量取2.2（1）项下的没食子酸、绿原酸和咖啡酸对照品溶液置于10ml棕色量瓶中，加流动相稀释，定容至刻度，混匀，使没食子酸的含量为0.27、0.54、1.08、2.16、4.32、8.64μg／ml，绿原酸含量为1.00、2.00、4.00、8.00、16.00、32.00μg／ml，咖啡酸含量为0.30、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60μg／ml。按2.1项下色谱条件进样20μl，测定峰面积（Y），以样品浓度（X）进行线性回归，计算回归方程。没食子酸：Y＝97 925 X－6 716.3，r＝0.999 9；绿原酸：Y＝83 908 X－ 19 783，r＝0.999 7；咖啡酸：Y＝187 005 X－15 809，r＝0.999 8。结果表明，没食子酸在0.27～8.64μg／ml、绿原酸在1.00～32.00μg／ml、咖啡酸在0.30～9.60μg／ml范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验 精密吸取对照品混合溶液20μl，按2.1项下色谱条件重复进样5次，按峰面积计算没食子酸、绿原酸和咖啡酸的日内RSD分别为0.62%、0.63%和0.62%（n＝5）。精密吸取对照品混合溶液20μl，每天测定1次，连续测定5d，记录峰面积，计算得到没食子酸、绿原酸和咖啡酸的日间RSD分别为0.81%、0.67%和0.72%（n＝5），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 按2.2（2）项下供试品溶液制备方法制备感冒安颗粒供试品溶液（批号120207），分别在0、2、4、6、8h各进样1次，记录峰面积，计算得到没食子酸、绿原酸和咖啡酸的RSD分别为1.26%、0.91%和0.93%（n＝5），表明供试品溶液在8h内稳定。

2.7 重复性实验 按2.2（2）项下供试品溶液制备方法制备5份感冒安颗粒供试品溶液（批号120207），按2.1项色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到没食子酸、绿原酸和咖啡酸的RSD分别为0.34%、1.86%和0.61%（n＝5），表明方法的重复性良好。

2.8 加样回收率实验 取同一批号已知没食子酸、绿原酸和咖啡酸含量的感冒安颗粒（批号120207，没食子酸含量约0.050mg／0.5g，绿原酸含量约0.710mg／0.5g，咖啡酸含量约0.054mg／0.5g）9份，每份约0.5g，精密称定，各加入没食子酸（0.051mg／ml）、绿原酸（0.650mg／ml）和咖啡酸（0.054mg／ml）对照品溶液1ml，分别按照2.2（2）项下方法制备供试品溶液并测定含量，计算样品的加样回收率。结果平均回收率分别为没食子酸100.14%，RSD＝1.66%（n＝9）；绿原酸98.10%，RSD＝2.38%（n＝9）；咖啡酸100.48%，RSD＝2.28%（n＝9）。

2.9 样品含量测定 取10个批号的感冒安颗粒，按2.2（2）项下方法制备成供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定峰面积，计算含量，结果见表1。

表1 感冒安颗粒中没食子酸、绿原酸和咖啡酸含量测定结果Table 1 Results of content determination of gallic acid，chlorogenic acid and caffeic acid in Ganmao’an granules（n＝3，±s）

表1 感冒安颗粒中没食子酸、绿原酸和咖啡酸含量测定结果Table 1 Results of content determination of gallic acid，chlorogenic acid and caffeic acid in Ganmao’an granules（n＝3，±s）

批号没食子酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）绿原酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）咖啡酸含量（Ddr／mg·g－1） RSD（%）111025 0.144±0.002 1.39 1.081±0.003 0.28 0.133±0.003 2.26 111121 0.122±0.002 1.64 1.271±0.011 0.87 0.115±0.003 2.61 111130 0.115±0.003 2.61 1.275±0.007 0.55 0.115±0.002 1.74 120207 0.099±0.001 1.01 1.421±0.012 0.84 0.108±0.002 1.85 120214 0.124±0.002 1.61 1.474±0.015 1.02 0.130±0.001 0.77 120314 0.114±0.002 1.75 0.980±0.013 1.33 0.117±0.003 2.56 120327 0.126±0.001 0.80 0.947±0.026 2.75 0.126±0.002 1.59 120328 0.122±0.003 2.46 0.964±0.012 1.24 0.132±0.002 1.52 120329 0.127±0.002 1.57 1.009±0.002 0.20 0.127±0.002 1.57 120330 0.127±0.001 0.80 0.983±0.021 2.14 0.121±0.001 0.83

3 讨 论

3.1 检测波长的选择 参考相关文献［8，9］及检测器的紫外扫描结果发现，没食子酸在272nm处有最大吸收，而绿原酸和咖啡酸在327nm处有最大吸收。为了确保检测灵敏度和准确性，本研究采用二极管阵列检测器，达到在两个波长处对3种酚酸类成分同时分别定量的目的。

3.2 流动相的选择 本研究曾用乙腈－0.4%磷酸（10∶90）、（5∶95）、（3.5∶96.5）和（3.3∶96.7）为流动相进行洗脱，样品中的其他峰未能与被测组分中的没食子酸很好地分离；最后选用本研究的流动相梯度洗脱，发现各峰分离度较好，且出峰时间适中。

3.3 结果分析 含量测定结果显示，不同批号的感冒安颗粒中没食子酸、绿原酸和咖啡酸的含量存在一定差异。不同批次的药材由于其产地、采收期的不同和干燥、加工炮制及储存过程中活性成分流失等可能会导致其含量不同；制剂储存时间的长短也有可能造成其含量的差异。由于本研究仅随机抽取10个批号的感冒安颗粒样品，因此对其中没食子酸、绿原酸和咖啡酸含量范围的确定还需要进一步研究。

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