韩 凌,彭 燕,孙 静,危建安

(1.广州中医药大学第二临床医学院,广州 510006;2.遵义医学院第五附属医院,广东珠海 519100)

氧化苦参碱对LoVo细胞Bcl-2､OCLN､TUBA1AmRNA表达的影响

韩 凌1,彭 燕2,孙 静1,危建安1

(1.广州中医药大学第二临床医学院,广州 510006;2.遵义医学院第五附属医院,广东珠海 519100)

目的探讨氧化苦参碱(OM)抑制人结肠癌LoVo细胞增殖和诱导凋亡的分子作用机制｡方法 采用实时荧光定量PCR法以及免疫组化法检测OM对LoVo细胞凋亡相关以及细胞骨架相关的B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)､微管蛋白1A(TUBA1A)､咬合蛋白(OCLN)的基因及蛋白表达的影响｡结果OM能显著抑制LoVo细胞增殖;可明显抑制LoVo细胞Bcl-2的mRNA以及蛋白的表达(P0.05),抑制TUBA1AmRNA表达,同时上调OCLN蛋白的表达,但并不能明显上调OCLN mRNA的表达｡结论OM抑制LoVo细胞增殖,可能与下调LoVo细胞Bcl-2､TUBA1A表达以及上调OCLN表达有关｡

肿瘤细胞,培养的;细胞凋亡;细胞骨架;氧化苦参碱

氧化苦参碱(oxymatrine,OM)是豆科槐属植物苦参(SophoraflavescensAit.)､苦豆子(S.AlopecuroidesL.)､广豆根(S.SubprostrataChun)等中草药的有效活性成分｡体外和体内实验研究已表明,OM对多种肿瘤细胞均具有抑制细胞增殖､诱导细胞凋亡的作用[1-3]｡以OM为主要成分的注射液具有明确的抗肿瘤作用,已广泛的应用于临床,但确切的分子机制并不明确｡因OM可导致细胞形态及数量发生变化,作者推测OM的作用机制可能与影响肿瘤细胞凋亡及细胞骨架相关基因及蛋白表达有关｡本研究选择人结肠癌LoVo细胞为研究对象,采用荧光定量PCR以及免疫组化法观察OM对LoVo细胞B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)､微管蛋白1A(tubulin alpha 1A,TUBA1A)､咬合蛋白(occludin,OCLN)等基因表达的影响,为OM在临床治疗上的应用提供实验依据｡

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 LoVo细胞为武汉中国生物品典藏中心保存,氧化苦参碱购于陕西一星生物制剂公司,胎牛血清购于美国Invitrogen公司,OCLN抗体购于Abcom公司,Bcl-2抗体､免疫组化试剂盒购于北京中衫金桥公司,MEM培养液､PBS､0.25%胰蛋白酶购于美国Invitrogen公司,TRIzol购于Invitrogen公司,PrimeScriptTM RT reagent kit和SYBR Premix Ex TaqTM试剂购于大连Takara公司,荧光定量PCR仪购于ABI公司,高速冷冻离心机购于Beckman公司,CO2培养箱购于Thermo公司,倒置显微镜购于日本NIKON公司,超净工作台购于新加坡ESCO公司｡

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与药物配制 人结肠癌LoVo细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基(含100U/mL青霉素和100U/mL链霉素),于37℃､饱和湿度､5%CO2培养箱中培养,细胞消化采用0.25%含EDTA胰蛋白酶｡OM采用无血清MEM配制成浓度为20mg/mL储存液,0.22μm一次性滤器过滤｡-20℃避光保存备用｡使用时配成终浓度为2mg/mL｡

1.2.2 实验分组 实时荧光定量PCR实验分3组,分别是:空白对照组(不加任何药物)､高剂量 OM 组(2mg/mL)及TNF-α组(100ng/mL);免疫组化检测分为3组,分别是:空白对照组(不加任何药物)､高剂量OM组(2mg/mL)及低剂量OM组(1mg/mL)｡各组均在细胞培养24h后加药,加药后继续培养24h或48h,进行实验｡

1.2.3 mRNA表达检测 每组设3个复孔,加药培养24h后,弃去培养液,用预冷的PBS洗涤1次,弃去PBS后加入1mL TRIzol并收集细胞,按说明书操作提取总RNA,用紫外分光光度计测定260nm及280nm处吸光度值(A260､A280),计算RNA样品的纯度和浓度｡按操作说明书合成cDNA｡按照SYBR Premix Ex TaqTM试剂说明进行实时荧光定量PCR反应,反应体系20μL,扩增条件:95℃30s预变性,95℃变性5s,60℃退火34s,40个循环,每份样品做复孔｡mRNA相对表达量用比较Ct值法计算,以看家基因GAPDH为内参,用看家基因和靶基因Ct值差(ΔCt)计算靶基因相对看家基因GAPDH 表达量[1/(2ΔCt)],与空白对照组比较,计算其他各组mRNA的相对表达量(Ratio)｡引物应用Invitrogen公司在线软件Oligo PerfectTMDesigner设计,用BLAST进行比对,由Invitrogen公司合成,实验用引物相关情况见表1｡

表1 实验所用引物

1.2.4 免疫组化检测 按试剂盒说明书进行｡4%多聚甲醛固定细胞后自然吹干,加1～2滴3%H2O2去离子水孵育10min,PBS洗3次,每次2min;将玻片吹干,每张玻片上滴加100μL×1/100Bcl-2,4℃冰箱孵育过夜;第2天取出,PBS洗3次,每次2min,加PV-6000 37℃孵育30min,PBS洗3次,每次2min;加DAB显色,流水清洗,晾干;中性树胶固定;显微镜观察拍照｡显色为棕色颗粒时表示特异蛋白阳性表达｡

1.3 统计学处理 特异基因mRNA表达结果采用t检验,以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 相关基因的特异性引物溶解曲线及扩增曲线 基因扩增后,Bcl-2､OCLN､TUBA1A和 GAPDH 基因扩增产物的熔解曲线､扩增曲线见图1､2｡各基因扩增曲线均呈明显的S型曲线,扩增产物的熔解曲线均为特异高尖的信号峰,说明扩增产物单一,无非特异性扩增片段｡

图1 各基因扩增产物的熔解曲线

图2 各基因扩增产物的扩增曲线

2.2 OM 对 LoVo细胞 Bcl-2､OCLN､TUBA1AmRNA 表达的影响 加药培养24h后,高剂量OM 组Bcl-2､TUBA1A mRNA明显下调,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);OCLN有上调趋势,但与空白对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)｡TNF-α组 Bcl-2､OCLN､TUBA1AmRNA表达的作用趋势与高剂量OM组一致,但与空白对照组比较,差异无统计学意义(P0.05)｡见表2｡

表2 OM 对LoVo细胞Bcl-2､OCLN､TUBA1AmRNA表达的影响(±s,n=3)

表2 OM 对LoVo细胞Bcl-2､OCLN､TUBA1AmRNA表达的影响(±s,n=3)

*:P0.05,与空白对照组相比｡

组别Bcl-2 OCLN TUBA1A空白对照组1.285±0.224 1.93±0.722 1.135±0.116高剂量 OM 组 0.799±0.139* 2.666±0.869 0.616±0.022*TNF-α组1.002±0.054 2.788±0.515 0.998±0.104

2.3 OM对Bcl-2蛋白表达的影响 Bcl-2主要表达于LoVo细胞的细胞质,空白对照组细胞数量较多,胞质内可见明显棕色染色;加药培养24h后,低剂量OM组LoVo细胞数量明显减少,与空白对照组比较,胞质内仅见浅黄棕色染色;高剂量OM组仅见少量LoVo细胞留存,棕色颗粒表达明显下调｡研究结果表明OM可明显下调LoVo细胞Bcl-2蛋白的表达｡见封2图3｡

2.4 OM对OCLN蛋白表达的影响 选取高､低剂量OM,分别作用LoVo细胞24､48h,观察OM对OCLN蛋白表达的影响,结果见封2图4及插Ⅰ图5｡OCLN主要表达于LoVo细胞膜上及胞质内｡空白对照组LoVo细胞OCLN表达较少｡加药培养24h后,低剂量OM组可见OCLN表达明显增多,细胞内棕色颗粒明显增多,染色加深;随着OM剂量的加大,细胞染色也逐渐加深｡加药培养48h后,高､低剂量OM组细胞数量相对于空白对照组明显减少,而细胞膜和细胞质内棕色颗粒随剂量增加而逐渐增加｡研究表明,OM可明显上调LoVo细胞OCLN蛋白的表达｡

3 讨 论

3.1 OM对LoVo细胞Bcl-2基因及蛋白表达的影响 人的Bcl-2基因是从大多数滤泡型非霍奇金B细胞淋巴瘤中分离获得的｡1988报道Bcl-2基因可使细胞存活时间延长｡1990年进一步确证Bcl-2基因具有抗细胞凋亡的功能后,Bcl-2基因作为重要的凋亡抑制基因,在多种肿瘤中得到证实｡近年来的研究表明,Bcl-2基因的异常表达,与肺癌的发生､发展､预后以及肿瘤耐药密切相关[4]｡徐康等[5]发现羟喜树碱可诱导结肠癌LoVo细胞凋亡,同时下调Bcl-2基因的表达,从而起到抗结肠癌细胞的作用｡本研究表明,OM可下调Bcl-2基因表达;同时用免疫组化方法进一步证实OM可下调Bcl-2蛋白表达,提示OM诱导LoVo细胞凋亡与影响Bcl-2基因与蛋白表达有关｡

3.2 OM对结肠癌LoVo细胞TUBA1A基因及蛋白表达的影响 肿瘤细胞的运动能力是浸润和转移的先决条件｡细胞骨架被认为是生长因子参与和作用的多种细胞反应的最初靶结构｡作为细胞骨架主要成分之一的微管,在细胞形态的维持､细胞运动以及在细胞分裂过程中发挥重要作用｡目前在真核生物中已经确定的微管蛋白有7种,其中a-tubulin和β-tubulin是微管结构的主要组成,在真核生物细胞中普遍存在,并且高度保守性[6]｡研究表明,tubulin表达在非小细胞肺癌(NSCLC)中增高可能表示预后不良,而且微管蛋白是紫杉醇作用的位点,与紫杉醇的获得性耐药也密切相关｡tubulin的表达与紫杉醇化疗敏感性相关,tubulin表达降低则对紫杉醇敏感性增加[7-8]｡本实验发现OM可明显下调TUBA1AmRNA表达,推测OM可能通过影响TUBA1A表达而影响LoVo细胞的形态以及运动能力｡而OM能否提高LoVo细胞对紫杉醇的敏感性仍需进一步研究｡

3.3 OM对结肠癌LoVo细胞OCLN基因及蛋白表达的影响 肿瘤细胞从原发部位解离是肿瘤侵袭､转移过程的第1个及重要环节｡而明确细胞解离机制则有利于阐明肿瘤侵袭转移的机制,并探索限制癌症侵袭转移的治疗新方法｡紧密连接是细胞间连接处的复杂结构,在细胞间黏着等生理学功能方面起重要作用｡紧密连接与细胞癌变有关,在上皮衍生癌中经常可发现紧密连接结构缺失｡电子显微镜证实,紧密连接在细胞癌变中逐渐减少｡OCLN是被克隆的紧密连接的第1个转膜蛋白,其不仅是紧密连接的结构成分,同时也是功能成分｡OCLN作为紧密连接的重要转膜蛋白可能在细胞解离过程中起重要作用[9]｡OCLN在胃肠分化腺癌中的表达水平与正常上皮细胞一致,但在低分化腺癌中表达水平显著降低[10]｡朱光能等[11]运用免疫组化技术检测OCLN在人肝细胞癌中的表达,并分析OCLN表达与肝癌发生､发展的关系｡结果表明OCLN主要定位于肝细胞膜,肝细胞癌与癌旁肝组织相比,OCLN表达阳性率及其强度均明显下降,其改变在肝细胞癌的发生发展中可能起重要作用｡本研究发现OM可上调OCLN基因表达,采用免疫组化方法进一步证实OM可上调OCLN蛋白表达,本研究结果提示,OM可能通过影响OCLN的基因与蛋白的表达,从而恢复肿瘤细胞中被破坏的紧密连接,影响肿瘤细胞的迁移,而起到抗肿瘤的作用｡

综上所述,OM抑制LoVo细胞增殖的作用,可能与下调细胞Bcl-2基因和蛋白表达有关｡另外,OM也可能通过下调TUBA1A,上调OCLN基因表达,从而影响LoVo细胞的形态､细胞周期以及运动与迁移的能力,而发挥抗癌的作用｡

[1] 张于人,朱金水,王小银,等.氧化苦参碱注射液联合小剂量紫杉醇对人胃癌SGC-7901细胞血管内皮生长因子及CXC趋化因子受体4表达的影响[J].中西医结合学报,2010,8(11):1029-1035.

[2] 张琼,潘平东.氧化苦参碱对人卵巢癌 HO-8910细胞的作用及其机制的初步研究[J].医学信息,2010,23(18):3381-3383.

[3] 万旭英,罗明,贺平,等.苦参碱和氧化苦参碱体外对人肝癌细胞的诱导分化作用[J].中国药理学通报,2009,25(7):977-979.

[4] 孟潘庆,胡国强.BCL-2基因研究进展[J].山东医药,2000,40(23);54-56.

[5] 徐康,范钰,林庚金.羟喜树碱对结肠癌LoVo细胞凋亡及bcl-2､p53 基 因 表 达 的 影 响 [J].上 海 医 学,2002,25(10):642-644.

[6] 盖领,茅国新.ERCC1､RRM1､β-tubulinⅢ在非小细胞肺癌化疗中作用的研究进展[J].重庆医学,2011,40(1):91-93.

[7] Dumontet C,Isaac S,Souquel PJ,et al.Expression of classⅢbeta tubulin in non small cell lung cancer is correlated with resistance to taxane chemotherapy[J].Bull Cancer,2005,92(2):25-30.

[8] 杜亚明,王宝华,王天一,等.NSCLC组织中β-微管蛋白Ⅲ､stathmin蛋白表达变化及意义[J].山东医药,2010,50(38):18-20.

[9] 周磊,谭晓冬,王巍,等.胰腺癌细胞解离中occludin和MEK/ERK信号通路的作用[J].外科理论与实践,2010,15(2):153-159.

[10]Kimura Y,Shiozaki H,Hirao M,et al.Expression of occludin,tight-junction-associated protein,in human digestive tract[J].Am J Pathol,1997,151(1):45-54.

[11]朱光能,承泽农,桂淑玉,等.Occludin表达与人肝细胞癌发生和发展的关系[J].蚌埠医学院学报,2004,29(4):286-288.

Effects of oxymatrine on expressions of Bcl-2,OCLN and TUBA1A in human colon carcinoma LoVo cells

,,,
(1.,,510006,;2.,,519100,)

ObjectiveTo explore the molecular mechanism of oxymatrine(OM)on inhibiting proliferation and inducing apoptosis in human colon carcinoma LoVo cells.MethodsUsing fluorescence quantitative PCR and immunohistochemistry assay to detect the effects of OM on apoptosis and cytoskeleton-related molecular gene and protein expression,such as Bcl-2,OCLN,TUBA1Aon LoVo cells.ResultsOM could inhibit LoVo cells proliferation and significantly inhibit Bcl-2gene and protein expression on LoVo cells.OM could also significantly inhibit TUBA1Agene expression on LoVo cells.OM showed only a slight increase trend on OCLN gene expression,but with immunohistochemical assay OM could significantly increase the OCLN protein expression on LoVo cells.ConclusionThe molecular mechanism of OM to inhibit tumor cell proliferation may be related to down-regulate Bcl-2and TUBA1Aexpression while increased expression of OCLN on LoVo cells.

tumor cells,cultured;apoptosis;cytoskeleton;oxymatrine

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.007

A

1671-8348(2012)18-1805-03

2011-10-09

2012-03-06)

•临床研究•