梁 兵,袁 芳,杨 宁,殷建瑞,蒲蜀湘,解龙昌,高庆春,高 聪△

(1.广州医学院第二附属医院神经科学研究所/神经内科,广州 510260;

2.广州医学院第五附属医院神经内科,广州 510700)

3种不同类型基因导入系统转染类神经元细胞的效率比较*

梁 兵1,袁 芳1,杨 宁2,殷建瑞1,蒲蜀湘1,解龙昌1,高庆春1,高 聪1△

(1.广州医学院第二附属医院神经科学研究所/神经内科,广州 510260;

2.广州医学院第五附属医院神经内科,广州 510700)

目的应用3种不同类型基因导入系统携带能表达绿色荧光蛋白的pAAV-EGFP质粒转染两类神经元细胞株,并对细胞毒性和转染效果进行比较｡方法 LipofectAMINE 2000､聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI,相对分子质量为25×103)及该课题组合成的PEI-聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)4.6在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和C6胶质瘤细胞中的转染效果,通过MTT法检测细胞存活率,倒置显微镜荧光观察法和流式细胞仪法检测转染效果｡结果MTT检测发现,在C6胶质瘤细胞中,PEG-PEI 4.6的细胞存活率为83%,比PEI(70%)和 LipofectAMINE 2000(73%)的细胞存活率要高(P0.05);但 LipofectAMINE 2000和PEI的细胞存活率比较,差异无统计学意义(P0.05);在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的检测结果与C6胶质瘤细胞类似｡倒置显微镜观察发现,在C6胶质瘤细胞中,PEG-PEI 4.6的细胞荧光表达效果比LipofectAMINE2000和PEI要好;而在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中,LipofectAMINE 2000的荧光表达效果比另外两种复合物的效果好,同时PEG-PEI 4.6的荧光表达效果比PEI要好｡流式细胞仪检测发现在C6胶质瘤细胞中,PEG-PEI 4.6的转染效率最好,为23.2%;LipofectAMINE2000其次,为16.9%;PEI最差,为12.6%,三者两两比较差异有统计学意义(P0.05)｡在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中则是LipofectAMINE 2000的转染效率最好,PEG-PEI 4.6其次,PEI最差,转染效率分别为22.3%､17.2%､10.6%,三者两两比较差异有统计学意义(P0.05)｡结论LipofectAMINE 2000和PEG-PEI 4.6都可作为目前神经系统基因转染的传输载体｡

神经胶质瘤;神经母细胞瘤;脂质体;转染

目前应用于基因治疗研究的基因转移载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类[1]｡常用的病毒载体,虽经遗传工程改造,去除了病原性而保留了基因转染效能,但制备困难､目的基因插入长度受限,还存在潜在的免疫反应和生物安全等问题｡非病毒载体大多制作简单､免疫原性低､不与宿主基因整合､可重复应用､克隆能力不受限,而其中的脂质体和纳米载体凭借其诸多优势,成为新型非病毒载体中研究的热点[2-3]｡

阳离子类脂类载体的研究起步较早,一些体系已经进入临床试验阶段[4],这类载体的一个主要缺点是在生理环境中具有尺寸多､分散性大,且易于聚集成大的颗粒而使细胞吸收效率降低;随着纳米技术的发展,纳米阳离子聚合物载体的稳定性更好,结构及性能也更容易调控,近年来成为基因传输研究中非常热门的领域[5]｡

通常培养的类神经元细胞和原代的神经细胞很难转染,转染试剂对培养基和血清的敏感性以及细胞毒性经常导致低转染率､低细胞低存活率和神经退行性变化,进而导致实验进程受阻[6-7]｡本研究比较了 LipofectAMINE 2000､聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI,相对分子质量为25×103)及本课题组应用过的PEI-聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)4.6在神经系统常用细胞——SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和C6胶质瘤细胞中的转染效果,以筛选出适合神经系统常用细胞的基因治疗载体,为基因技术在神经系统常用细胞中的应用研究提供指导｡

1 材料与方法

1.1 材料 LipofectAMINE 2000､DMEM培养基购自Invitrogen公司;PEI购自BASF公司;PEG购自韩国湖南化工公司,制备成PEI-PEG 4.6｡胎牛血清购自 Hyclone公司;余为国产分析纯试剂｡

1.2 细胞来源及培养 C6胶质瘤细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞购自美国ATCC公司,由本实验室保存｡用加有10% 胎牛血清(FBS)和1%抗生素(青霉素/链霉素)的DMEM培养基在5%CO2培养箱37℃中培养｡

1.3 质粒DNA(pDNA)的制备 本研究应用能表达绿色荧光蛋白的pAAV-EGFP｡质粒在大肠杆菌中扩增,然后用QIAGEN试剂盒提取纯化｡得到的质粒通过紫外分光计在260和280nm波长处检测其含量;在1.0%的琼脂糖凝胶上以100V电压电泳40min,检测其完整性｡检测合格的质粒保存于―20℃备用｡

1.4 LipofectAMINE2000/pDNA复合物的制备 在Eppendorf管中,将1μg pDNA稀释在50μL不含FBS的DMEM中,振荡均匀,然后与2μL LipofectAMINE 2000进行混合在室温下振荡5min得到均匀复合物｡

1.5 PEI/pDNA和 PEI-PEG 4.6/pDNA 复合物的制备 在Eppendorf管中,将1μg pDNA稀释在50μL不含FBS的DMEM中,振荡均匀,按N/P=15把相应量的PEI或PEIPEG 4.6加入到另外一管装有50μL不含FBS的DMEM的Eppendorf管中,然后把两溶液在室温下振荡5min得到均匀复合物｡

1.6 细胞毒性检测(MTT法) 两种细胞以每孔6 000个细胞接种在96孔板中;24h后每孔加入含有150ng pAAV-EGFP的聚合物/pDNA复合物的150μL不含血清培养液进行转染,每个N/P浓度复制在4个孔中,48h之后加入20μL MTT溶液(5mg/mL),继续培养4h,小心吸出孔内培养上层清液后,加入100μL二甲基亚砜(DMSO),室温振荡5min后,通过化学发光酶标仪测定在570nm处的吸光值｡

1.7 转染效果检测

1.7.1 转染过程 两种细胞以1×105细胞每孔接种在24孔板上培养24h,待细胞丰度70%,在转染前4h移去培养基,先用等量(400μL)DMEM(无血清)培养基清洗,再用等量(400μL)DMEM(无血清)培养基替换｡直接将50μL复合物加入每孔中,摇动培养板,轻轻混匀｡在37℃､5%CO2培养箱中培养4～5h,更换含血清和抗生素的培养基,培育48h｡

1.7.2 倒置荧光显微镜观测 转染48h后通过倒置荧光显微镜观测pDNA在两种细胞中的转染效果,观察绿色荧光蛋白信号,照片用Nikon荧光软件捕获｡阳性细胞发出明亮的绿色荧光,而阴性细胞则无｡

1.7.3 流式细胞仪观测 转染48h后弃去上层培养液,细胞用500μL Hank′s平衡盐溶液悬浮,然后应用流式细胞仪AriaTM系统计数表达绿色荧光蛋白的细胞的百分比,每种细胞重复3次取平均值｡

1.8 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,实验数据采用±s表示,多组间两两比较采用方差分析,以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 细胞毒性检测结果 所有的材料载体对C6胶质瘤细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞都有一定的细胞毒性｡在C6胶质瘤细胞中,PEG-PEI 4.6的细胞存活率为83%,比 PEI(70%)和LipofectAMINE 2000(73%)的细胞存活率要高(P0.05);LipofectAMINE 2000和PEI的细胞存活率比较差异无统计学意义(P0.05)｡在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中的检测结果与C6胶质瘤细胞类似｡见图1｡

图1 细胞毒性检测结果

2.2 倒置荧光显微镜观测细胞转染效果 为了直观检测各种载体的转染效果,载体与pAAV-EGFP复合后,在两种细胞中进行转染,然后分别用倒置荧光显微镜观测｡在C6胶质瘤细胞 中,PEG-PEI 4.6 的 细 胞 荧 光 表 达 效 果 比 LipofectAMINE2000和PEI要好,见图2｡而在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中,LipofectAMINE 2000的荧光表达效果比另外两种复合物的效果好,同时在这种细胞中PEG-PEI 4.6的荧光表达效果比PEI要好,见图3｡在两种细胞中PEI的转染效果最差,可能与其毒性最大有关｡

图2 3种基因导入系统在C6胶质瘤细胞中转染效率观察(×100)

2.3 流式细胞仪检测细胞转染效果 为进一步明确3种基因导入系统在两种细胞中的转染效率,作者利用流式细胞仪检测了两种细胞中3种基因导入系统的转染效率,结果发现在C6胶质瘤细胞中PEG-PEI 4.6的转染效率最好,为23.2%;LipofectAMINE2000其次,为16.9%;PEI最差,为12.6%,三者两两比较差异有统计学意义(P0.05)｡在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中则是LipofectAMINE 2000的转染效率最好,PEG-PEI 4.6其次,PEI最差,效率分别为22.3%､17.2%､10.6%,三者两两比较差异有统计学意义(P0.05)｡见图4｡

图3 3种基因导入系统在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中转染效率观察(×100)

图4 流式细胞仪检测细胞转染效果

3 讨 论

安全高效的基因传输载体是实现基因治疗的关键之一｡非病毒载体具有易于合成和改性､无免疫原性等优点使其成为基因载体的一种重要类型;但由于其具有对细胞有正电荷相关的毒性､转染效率较病毒载体低､缺乏传输特异性等缺点制约了其在临床上的应用[8-9]｡

其中阳离子脂质体是磷脂和其他亲水亲组性物质分散于水中,由一层或多层同心的脂质双分子膜包封而成的超微球状载体制剂｡脂质体具有的双重特性——亲水性和疏水性,决定了脂质体可以较好地包裹亲水性物质和亲脂性物质,因此,脂质体是目前运用较广泛的基因载体之一[10]｡但阳离子脂质体细胞毒性相对较高,对不同的细胞可能会干扰细胞的代谢[4]｡

阳离子纳米颗粒是一种直径在1～100nm之间的超微粒子,具有表面效应､小尺寸效应和宏观量子隧道效应等[11]｡基因转染时将基因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,在细胞摄粒作用下,纳米颗粒进入细胞内,释放基因治疗分子,发挥其基因治疗效能[12-13]｡纳米颗粒基因转移载体是目前极为有效的非病毒载体,其转染效率较传统方法高百倍[14]｡

基因载体的转染效率是和纳米材料或者脂质体的细胞毒性相关的,如果复合物的毒性比较高,则相应的转染表达水平也要下降｡MTT比色法是免疫学衡量细胞增殖的经典方法,本研究采用了 MTT实验研究了LipofectAMINE 2000､PEI､PEI-PEG 4.6这3种材料载体各自复合pDNA后的细胞毒性,C6胶质瘤细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞种,PEG-PEI 4.6的细胞存活率为83%,比PEI(70%)和LipofectAMINE 2000(73%)的细胞存活率要高｡说明纳米材料在改造后同样用量的时候毒性大大降低了[15]｡

为了衡量转染效果,各种材料的复合物在C6胶质瘤细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中进行转染,分别更直观地在荧光显微镜下观测以及流式细胞仪检测｡在C6胶质瘤细胞中,PEG-PEI 4.6转染的绿色荧光蛋白表达水平比LipofectAMINE 2000和PEI都高;而在SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中,LipofectAMINE 2000的绿色荧光蛋白表达水平比另外两种载体的表达水平都高｡这可能是由于细胞类型表面表达受体不同导致的[7]｡流式细胞仪检测结果也证实了荧光显微镜下观测所得的结果｡

由此可以得出,LipofectAMINE 2000和PEG-PEI 4.6都可以作为C6胶质瘤细胞和SY5Y神经母细胞瘤细胞基因传输的载体,但由于LipofectAMINE 2000商品化程度比较高,而且表达相对稳定,虽然有部分毒性作用,但仍然可作为目前神经系统基因转染的传输载体｡而PEG-PEI 4.6作为PEI的常见的改进品,各方面的性能都优于PEI,具有很高的可塑性和提升空间｡

[1] Suk JS,Suh J,Lai SK,et al.Quantifying the intracellular transport of viral and nonviral gene vectors in primary neurons[J].Exp Biol Med,2007,232(3):461-469.

[2] Lotem M,Zhao Y,Riley J,et al.Presentation of tumor antigens by dendritic cells genetically modified with viral and nonviral vectors[J].J Immunother,2006,29(6):616-627.

[3] Mcmahon JM,Conroy S,Lyons M,et al.Gene transfer into rat mesenchymal stem cells:a comparative study of viral and nonviral vectors[J].Stem Cells Dev,2006,15(1):87-96.

[4] Obata Y,Gianni C,Raffa V,et al.Evaluation of cationic liposomes composed of an amino acid-based lipid for neuronal transfection[J].Nanomedicine,2010,6(1):e70-77.

[5]Jonathan DE,Bielinska AU,Kukowska-Latallo JF,et al.The use of PAMAM dendrimers in the efficient transfer of genetic material into cells[J].Pharm Sci Technolo Today,2000,3(7):232-245.

[6] Martín-Montañez E,López-Téllez JF,Acevedo MJ,et al.Efficiency of gene transfection reagents in NG108-15,SH-SY5Y and CHO-K1cell lines[J].MethodsFind Exp Clin Pharmacol,2010,32(5):291-297.

[7] Suk JS,Suh J,Choy K,et al.Gene delivery to differentiated neurotypic cells with RGD and HIV Tat peptide functionalized polymeric nanoparticles[J].Biomaterials,2006,27(29):5143-5150.

[8] Kealy B,Liew A,Mcmahon JM,et al.Comparison of viral and nonviral vectors for gene transfer to human endothelial progenitor cells[J].Tissue Eng Part C Methods,2009,15(2):223-231.

[9] Rejman J,De Fino I,Paroni M,et al.Impact of chronic pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa on transfection mediated by viral and nonviral vectors[J].Hum Gene Ther,2010,21(3):351-356.

[10]Chen YX,Qiao WH,Liu DL,et al.The mechanism and efficiency affecting factor of cationic liposome transfection[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2007,23(5):776-780.

[11]Ravi Kumar M,Hellermann G,Lockey RF,et al.Nanoparticle-mediated gene delivery:state of the art[J].Expert Opin Biol Ther,2004,4(8):1213-1224.

[12]Bozkir A,Saka OM.Chitosan-DNA nanoparticles:effect on DNA integrity,bacterial transformation and transfection efficiency[J].J Drug Target,2004,12(5):281-288.

[13]Salah-Eddine S,Holger F,Haag R.Dendritic polymers in biomedical applications:From potential to clinical use in diagnostics and therapy[J].Angew Chem Int Ed Engl,2002,41(8):1329-1334.

[14]Kumar A,Yellepeddi VK,Davies GE,et al.Enhanced gene transfection efficiency by polyamidoamine(PAMAM)dendrimers modified with ornithine residues[J].Int J Pharm,2010,392(1/2):294-303.

[15]Liang B,He ML,Xiao ZP,et al.Synthesis and characterization of folate-PEG-grafted-hyperbranched-PEI for tumor-targeted gene delivery[J].Biochem Biophys Res Commun,2008,367(4):874-880.

The comparison of the transfection efficiency of three different types of gene expression system in the neurotypic cell lines*

,,,,,,,
(1./,
,,510260,;2.,,,510700,)

ObjectiveUse three different types of gene expression system carry the pAAV-EGFP plasmid can express green fluorescent protein to transfect the neurotypic cell lines and to compare their cell toxicity and their transfection effects.MethodsWe used the commercial liposomes and nanoparticles such as the LipofectAMINE 2000,the PEI(25×103)and PEG-PEI 4.6as the gene expression system,carry the pAAV-EGFP plasmid to transfect the commonly used neurotypic cells in nervous system cells such as the SH-SY5Yneuroblastoma cells and C6glioma cells.Then we detected the cell toxicity through the MTT method,and detected the transfection effects by the inverted microscope fluorescent observation and the flow cytometric method.ResultsMTT detectionResultsshowed the cell survival rate of PEG-PEI 4.6(83%)was higher than PEI(70%)and LipofectAMINE 2000(73%)in the C6glioma cells(P0.05),but the compare of the cell survival rate of PEI and LipofectAMINE 2000had no statistical significance(P0.05);The similarResultswere in the SH-SY5Yneuroblastoma cells.The inverted microscope fluorescent observed in C6glioma cells the PEG-PEI 4.6had higher fluorescence expression than LipofectAMINE2000and PEI.While in SH-SY5Yneuroblastoma cells,the LipofectAMINE2000had higher fluorescence expression than other two materials.At the same time,the PEGPEI 4.6had higher fluorescence expression than PEI.The flow cytometricResultsshowed in C6glioma cells the PEG-PEI 4.6had the best efficiency to 23.2%,LipofectAMINE2000was next of 16.9%,the worst PEI was 12.6% (P0.05);In SH-SY5Yneuroblastoma cells LipofectAMINE2000had the best efficiency,PEG-PEI 4.6second,and PEI was the worst(P0.05),the efficiency of them was 22.3% ,17.2%and 10.6%respectively.ConclusionAt present LipofectAMINE 2000and PEG-PEI 4.6can serve as the gene transfection carrier of the nervous system.

glioma;neuroblastoma;liposomes;transfection

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.003

A

1671-8348(2012)18-1792-03

* 基金项目:国家自然科学基金青年项目(81100890);广东省自然科学基金资助项目(10151018201000022);广东省博士启动项目(10451018201004383);广州市属高校羊城学者科研项目(10A010G);广州医学院博士启动基金(2008c46)｡△

,E-mail:smilegaocong@163.com｡

2012-03-02

2012-04-22)

•临床研究•