赵 晋，汤 泓，李红霞

（首都医科大学附属北京世纪坛医院 妇产科，北京100038）

卵巢癌是一种多因素、多基因参与的复杂疾病。随着人类基因组计划的完成，人们更加清楚地认识到：基因组是一个静态的信息源，它具有确定的基因内容，即无论细胞类型或环境条件如何，除极少数情况外，它总是维持不变。因此，基因间的功能关系必须在转录和蛋白质组水平上加以研究。蛋白质组（proteomics）是在一定条件下由一个特定的细胞或生物体产生的所有蛋白质。细胞通过调控其蛋白质的表达水平和活性来适应内外环境的改变，所以，蛋白质组无论是在质或量上的改变都反映了处于功能活动中的细胞的一种状况［1，2］。因此用蛋白质组学方法从整体水平上研究肿瘤的发病机制，寻找肿瘤诊断和预后的特异性标志物，以及药物治疗的靶标等均已成为近期研究的热点。

本研究采用最常用的一种蛋白指纹图谱技术——表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI－TOF－MS），对就诊于我院并进行手术治疗及术后化疗的9例卵巢癌患者进行了跟踪随访，共收集到37份血清标本。对上述标本分别进行了蛋白质谱分析，观察卵巢癌患者术前、术后、复发及化疗过程中血清蛋白质变化，探讨卵巢癌发生、发展及复发过程中血清质谱多肽蛋白图谱变化，旨在筛选新的与卵巢癌发生、发展与复发密切相关的蛋白质或多肽，为临床诊断卵巢癌提供可能的血清肿瘤标志分子。

1 材料和方法

1.1 研究对象

所有血清标本均取自北京世纪坛医院妇科初诊卵巢癌患者。7例卵巢癌患者的年龄为40－69岁，平均52.8岁。均为浆液性腺癌。均收集术前（7份）、术后（不同时间22份）血清标本。其中复发患者3例，包括复发后（不同时间8份）血清标本。血清标本总数共37份。

按2000年国际妇产科联盟（FIGO）手术病理分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期5例。术式均采用肿瘤细胞减灭术，均在术后2周内开始接受正规化疗，采用化疗方案为Pt（顺铂＋紫杉醇）或PC（顺铂＋环磷酰胺）。所有患者的组织标本均经术后病理证实。

1.2 主要试剂与仪器

尿素（urea）、乙腈（CAN）、3－环乙胺－1－丙磺酸（CHAPS）、三氟乙酸（TFA）、芥子酸（SPA）均购自Sigma公司；SELDI质谱仪及CM 10弱阳离子芯片购自于美国BIORAD公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的收集与血清样本制备 将采集的静脉血4℃静置2h后离心（4 000rpm，10min），取上清液按100μl/管分装，置于－80℃冰箱中保存，冻存前在标本管上详细标号。－80℃冰箱中取出血清样品，置冰盒上融解；以10，000rpm，4℃离心2 min；每个样品取10μl分别置于1.5ml离心管中，加20μl U9缓冲液稀释，充分混匀；将以上样品冰浴振荡30min（或每隔5min用手指轻弹混匀一次）。将30μl上述变性后样品加入370μl相应的结合缓冲液，使得血清的总稀释倍数达到40倍。混匀，避免气泡产生。

1.3.2 SELDI－TOF－MS检测 取出 CM10的芯片，在芯片背后标记时间，芯片种类，操作者的姓名等资料。将芯片装入生物芯片处理器。每孔加入200μl结合缓冲液（50mM NaAC，pH 4.0），置振荡器400－600rpm/min震荡5min，甩掉缓冲液。重复上述操作一次。在芯片处理器每孔中加入100μl处理好的样品，置振荡器400－600转/min，4℃震荡1h。甩出样品，重复操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。立刻拆开芯片处理器，取出芯片后，待干后，在每个加样孔上加SPA 0.5μl，待干后，重复加SPA 0.5μl一次。待干后，即可上机测定。

在读取数据前，用加有All－in－one标准蛋白质的NP20芯片校正质谱仪，使分子量误差＜0.1%。设定仪器主要参数：激光强度130，检测灵敏度8，优化分子量范围2 000－15 000Da，最佳聚焦中心6000，数据采集参数范围20－80，收集点数为100次。设定读片程序，计算机根据所获得的原始数据快速精确地绘制出蛋白质质谱图，其中纵坐标为波峰强度，即蛋白质相对含量，横坐标为质荷比（M/Z），即蛋白质相对分子量。

1.4 统计学方法

应用Biomarker Wizard和Patterns软件分析处理所有峰谱，形成蛋白指纹图谱。用SPSS 13.0软件对各组血清的波峰强度进行统计学分析（符合方差齐性的应用方差分析，不符合方差齐性的用多个独立样本的非参数检验），然后应用Biomarker Patterns软件建立树形分类模型。

2 结果

2.1 通过SPSS 13.0软件统计分析，在7份卵巢癌术前、22份卵巢癌术后及8份复发性卵巢癌患者的血清蛋白中共检测到26个差异表达的蛋白（P＜0.05）。

在卵巢癌术前、术后自身对照研究中，卵巢癌术前组蛋白峰平均强度/卵巢癌术后组蛋白峰平均强度≥2的蛋白峰有1个（1452.58Da），说明该蛋白峰在卵巢癌术前组中高表达。卵巢癌术前组蛋白峰平均强度/卵巢癌术后组蛋白峰平均强度≤0.5的蛋白峰有4个（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），其中 m/z为8785.20的蛋白峰与Apo C－Ⅲ的质核比相符。说明该蛋白峰在卵巢癌术前组中低表达。

2.2 在卵巢癌术前、术后及复发组对照研究中，差异表达的蛋白峰有2个，其中m/z7991.89Da的蛋白峰术前、术后及复发时的蛋白质平均强度分别为14.67、5.75、12.28（P值＝0.002）；m/z 8093.54Da的蛋白峰术前、术后及复发时的蛋白质平均强度分别为3.12、0.71、2.81（P值＝0.002）。

3 讨论

3.1 患者手术前后差异表达的蛋白峰的意义

卵巢恶性肿瘤的发病率，在女性常见恶性肿瘤中所占的百分率为2.4%－5.6%。在女性生殖道癌瘤中占第3位，次于宫颈癌及宫体癌。而在女性生殖道癌瘤中，卵巢癌是死亡率最高的一种肿瘤［3］。据文献报道，目前卵巢癌总的治疗有效率为70%－80%，然而经病理学证实完全有效者，复发率仍为40%－60%。因此，对卵巢癌患者进行有效的随访观察，尽早发现肿瘤复发具有重要的意义。

本研究选取了7位卵巢癌患者进行手术前后自身对照研究。我们设想的是，手术可明显减少肿瘤负荷，因此，应用SELDI－TOF－MS技术检测卵巢癌患者手术前后自身对照血清蛋白质成分的改变，有望了解患者进行肿瘤细胞减灭术的效果和机体对手术的反应程度，并可筛选出评价手术效果及判定复发的潜在标志物。结果显示卵巢癌患者在术前及术后存在差异表达的蛋白峰，这些蛋白峰可能来自自于宿主器官、病变本身或机体的代谢或免疫产物，得到有统计学差异的蛋白峰5个，推测它们可能是卵巢癌发生及发展中具有功能的一组蛋白或多肽。其中卵巢癌术前组蛋白峰平均强度/卵巢癌术后组蛋白峰平均强度≥2的蛋白峰有1个（1452.58Da），说明该蛋白峰在卵巢癌术前组中高表达。推测可能是因为该蛋白在肿瘤组织中表达增强，可能与肿瘤的发生发展有关，而术后肿瘤负荷降低，该蛋白峰表达下降。卵巢癌术前组蛋白峰平均强度/卵巢癌术后组蛋白峰平均强度≤0.5的蛋白峰有4个（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），说明该蛋白峰在卵巢癌术前组中低表达。推测可能是机体产生的重要的保护因素或抑癌因子，术后肿瘤负荷降低，对免疫因子的消耗减少，故术后血清中相应蛋白含量升高；也有可能是与代谢有关的蛋白，术后肿瘤负荷降低，代谢水平降低，消耗较少，故相应蛋白水平升高。本研究中，通过对蛋白质组学的同源性分析，发现m/z为8785.20的蛋白峰与载脂蛋白Apo C－Ⅲ的质核比相符。观察该蛋白峰在术前术后及复发时的变化，可见该蛋白峰在术前低表达，术后表达升高，与文献报道一致［4－6］。说明该蛋白峰与肿瘤的发生和发展密切相关。推测其可能因肿瘤存在，代谢旺盛，肿瘤负荷加大了该蛋白的消耗。

3.2 卵巢癌复发患者差异表达的蛋白峰的意义

在卵巢癌领域内，尽管迄今对复发性卵巢癌的治疗仍为姑息性治疗，但是，对于复发性卵巢癌患者来说，及早明确诊断并治疗，对于延长生存时间及改善生存质量有着重要意义。本研究中，我们选取了卵巢癌术前、术后及复发组进行蛋白质组学对比研究，我们设想的是，手术可明显减少肿瘤负荷，而术后复发，肿瘤负荷再次加大，蛋白峰的变化应与术前－术后的变化趋势相反，但术前及复发组因肿瘤负荷不同，故变化幅度可能会与术前－术后不同。因此，应用SELDI－TOF－MS技术检测卵巢癌患者手术前后及复发组对照血清蛋白质成分的改变，有望了解手术及肿瘤复发对机体影响及机体的反应，并可筛选出评价手术效果及判定复发的潜在标志物。结果发现符合卵巢癌术前组峰值平均强度/术后组峰值平均强度≥2且卵巢癌术后组峰值平均强度/复发组峰值平均强度≤0.5的蛋白峰有2个（7991.89Da，8093.54Da）说明该蛋白峰在机体存在肿瘤时表达增强。推测该蛋白峰可能来自于肿瘤组织，在肿瘤发生及发展过程中不断释放入血而引起血清该蛋白或肽段含量升高。

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