茅卫锋，臧师竹，杨文波

(大连医科大学 生物技术系，辽宁 大连 116044)

对阳性基因敲除细胞的筛选是顺利完成基因敲除的重要步骤。现在普遍使用PCR方法进行快速筛选，一个引物位于筛选标记中，一个引物位于同源臂外面，根据有无PCR产物鉴定阳性基因敲除细胞，这种筛选方法的缺点是没有阳性对照，从而导致筛选效率低下。本研究将野生型基因敲除位点内的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除质粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并设计与之配对的流动引物。流动引物为PCR下游引物，利用来自同源臂外DNA序列设计PCR上游引物，使用这对引物PCR扩增，野生型和基因敲除阳性细胞克隆都能够得到PCR产物。正常双倍体细胞只有一个PCR产物，而细胞一个等位基因被敲除后，细胞含有一个野生型等位基因和一个敲除的基因座位，利用流动引物，可以得到两个PCR产物，一个为野生型较大PCR产物，一个是敲除后较小的PCR产物。流动引物PCR筛选克服普通筛选过程中没有阳性对照的缺点，可以提高筛选阳性基因敲除细胞的效率。利用流动引物，作者成功在小鼠体细胞CH12中筛选到XRCC1一个等位基因敲除的阳性克隆子。报告如下。

1 材料和方法

1.1 构建含有流动引物的XRCC1基因敲除质粒

引物WM11 5’ GTACC CTTTGACCCTCACTGCCAAT 3’和WM12 5’ AATTC ATTGGCAGTGAGGGTCAAAG 3’退火形成双链DNA linker。KpnI和EcoRI酶切XRCC1基因敲除质粒pWM3，将linker在DNA T4 连接酶 (Promega，USA)作用下连接到双酶切的pWM3中，得到含有linker的基因敲除质粒pWM4 (图 1)。WM11为流动引物，设计筛选阳性基因敲除克隆子的上游PCR引物WM5 5’ GTCCTCAGGAGGGAAGGCTA 3’。

图1 流动引物PCR筛选示意图Fig 1 Diagram of floating primer PCR screening

1.2 XRCC1基因敲除质粒电转到小鼠体细胞CH12中

使用Amaxa哺乳动物电转化系统 (Amaxa，USA)将基因敲除质粒pWM4转入小鼠体细胞系CH12中。嘌呤霉素(Puromycin)筛选嘌呤霉素抗性细胞克隆。提取细胞总DNA。

1.3 使用流动引物筛选阳性基因敲除克隆子

使用流动引物WM11和上游引物WM5，PCR筛选阳性克隆子 (图1)。PCR程序 94 ℃ 3 min；30个循环，每个循环中94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸3.5 min；72 ℃ 5 min。

2 结 果

2.1 阳性基因敲除细胞的筛选

使用流动引物和PCR上游引物，正常基因型细胞显示一个3.0 kb PCR产物(图2)，1个等位基因被敲除细胞显示两个PCR产物，3.0 kb的PCR产物是XRCC1正常基因型，2.5 kb 的PCR产物是XRCC1外显子被敲除后的基因型(图2)。

图2 PCR产物电泳图Fig 2 The electrophoregram of PCR products

正常野生型XRCC1基因只有一个PCR产物。红色星号为阳性基因敲除克隆：3 kb PCR产物为野生型基因型，2.5 kb PCR产物为基因敲除基因型。

Normal wild type XRCC1 gene generates one PCR product. The red asterisks are the positive gene knock out clones：3 kb PCR products show the wild type genotype. 2.5 kb PCR product show the gene knock out genotype.

2.2 PCR筛选基因敲除细胞的效率

本研究挑取100个嘌呤霉素抗性单克隆细胞分析基因敲除效率，PCR筛选结果显示有3个单克隆细胞为单个等位基因敲除的阳性细胞克隆 (表 1)，显示敲除单个等位基因阳性率为3%。

表1 使用流动引物筛选XRCC1基因敲除细胞效率Tab 1 The efficiency of utilizing floating primer to screen XRCC1 gene knock out cells

3 讨 论

基因敲除技术做为一种强有力的研究基因功能的工具，已经应用于生命科学和医学几乎所有的研究领域[1-3]。 通过基因敲除技术研制的人类疾病小鼠模型已经超过500种[4-6]。本研究尝试在小鼠体细胞CH12中敲除XRCC1的一个等位基因，并探索使用流动引物高效筛选阳性克隆。多种因素影响体细胞基因敲除的效率，首先基因敲除细胞系的选择非常重要，通常选择具有稳定染色体组的二倍体细胞进行敲除，设计打靶载体分别敲除位于两个染色体上的一对等位基因。在选择要进行基因敲除的细胞系时，要尽量选择遗传背景清楚，最好已经有成功例子的细胞系。对阳性基因敲除细胞的筛选，现在通常都会先使用PCR方法做第1轮的筛选， PCR结果呈阳性的细胞用Southern Blot确认。

本实验报道利用流动引物的方法增加PCR筛选的效率。常规PCR筛选时，设计一个引物位于筛选标记中，一个引物位于同源臂外面，根据有无PCR产物鉴定阳性基因敲除细胞。基因打靶的同源短臂>2 kb，PCR横跨过同源臂，所以PCR产物一般都接近3 kb, 这种长度PCR失败的可能性比较高，而筛选没有任何阳性对照，只是根据有没有PCR结果判断基因敲除是否成功，导致筛选的效率低下，经常会因为PCR本身的原因漏检了阳性基因敲除细胞。本实验将野生型基因敲除位点内的20 bp DNA序列人工合成，加到基因敲除质粒嘌呤霉素抗性基因5’端，并设计与之配对的流动引物。使用流动引物PCR扩增，野生型和基因敲除阳性细胞克隆都能够得到PCR产物。正常双倍体细胞只有一个PCR产物，而细胞一个等位基因被敲除后，利用流动引物，可以得到两个PCR产物，一个为野生型较大PCR产物，一个是敲除后较小的PCR产物。 使用流动引物PCR筛选可以克服普通筛选过程中没有阳性对照的缺点，作者使用流动引物PCR筛选XRCC1基因敲除细胞克隆，筛选阳性克隆效率为3%。 本实验结果显示流动引物可以显著增加阳性基因敲除细胞的筛选效率。

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