朱锦辉 裘华森

(浙江中医药大学第一临床医学院,浙江 杭州 310006)

人工血管是重要的血管移植物,已被广泛地用于血管重建。但在人工血管置换病变的静脉和口径小于6mm的动脉时,常因腔内血栓形成而闭塞。其主要原因是人工血管不具备与自体血管相同的内膜和内皮细胞(EC)。研究表明,在人工血管内壁种植内皮细胞,使其早期快速内皮化,可以改善移植血管的通畅性[1],但种植的单层内皮细胞往往粘附力差,在血流的冲击下容易脱落[2]。提高内皮细胞的黏附性有着重要意义。本研究采用bFGF预处理人工血管用再种植内皮细胞,以期提高内皮细胞的保存率。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 3月龄新西兰白兔6只,由浙江中医药大学动物实验中心提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 内皮细胞取自人大隐静脉,用标准酶分离技术和细胞培养技术[1]。在细胞培养过程中,在培养液中加入含lacZ基因的逆转录病毒载体,使内皮细胞事先载入lacZ基因,可通过X-gal染色确认内皮细胞。逆转录病毒载体保存于293T/17包装细胞(美国ATCC公司),采用含10%胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)和2mol/L的DMEM 131培养基(Hyclone公司)包装细胞,并扩增逆转录病毒载体。

1.2.2 人工血管 选用聚四氟乙烯人工血管(PTFE)(IMPRA,Inc·,AZ)6根,内径 4mm,试验组3根经bFGF溶液(北京鑫琪百奥公司)预衬处理,即在人工血管腔内加压灌注bFGF溶液(0.1 mg/mL),直至外壁出现“冒汗”现象;对照组3根人工血管不予处理。

1.2.3 细胞种植 两组人工血管内分别注入内皮细胞悬浮液(3×105cells/mL),二端加热封闭,在37℃条件下,以每10分钟1次转动人工血管共2小时,使细胞均匀附着排列于内壁。然后剪开封闭口,将此人工血管放入DMEM 131培养液中孵育24小时。使内皮细胞在内壁黏附生成完成细胞种植。

1.2.4 体内灌注试验 实验用3月龄新西兰白兔随机分为2组,每组各3只,取EC种植的人工血管2/3段植入兔腹主动脉,采用血管旁路方式,术中注意避免损伤人工血管内壁上的细胞,手术前后给予适当抗凝剂,术后应用甲基泼尼松龙抑制急性排斥反应,植入2小时后取出观察。

1.2.5 细胞计数检查 体内灌注前后各取人工血管标本3段,纵形剖开,磷酸缓冲液轻柔漂洗,10%甲醛固定,X-半乳糖苷染色显示种植的内皮细胞,相差显微镜(40倍)计数内皮细胞,每段随机取10个视野计数,共30个视野,计算其平均值。

2 结 果

细胞种植后内皮细胞密度观察 对照组未经任何预衬处理的人工血管,细胞种植成功率低,内皮细胞密度仅为(167±14)cell/mm2。试验组经bFGF预衬处理的人工血管,内皮细胞种植后,人工血管内壁内皮细胞密度达到(364±19)cells/mm2,见表1。

体内循环灌注实验 在兔腹主动脉灌注2小时后,人工血管内种植的细胞均有脱落现象,其中单纯内皮细胞种植组71%细胞脱落,而bFGF预衬处理EC种植组仅有38%内皮细胞脱落,该种植组细胞保存率达62%,明显高于单纯内皮细胞种植组29%(P＜0.01),见表1。

表1 灌注前后人工血管腔面种植细胞密度和保存率比较±s)

表1 灌注前后人工血管腔面种植细胞密度和保存率比较±s)

与对照组比较**P＜0.01

组 别 n 细胞数(cells/mm2)灌流前 灌流后保存率(%)对照组 30 167±14 48±19 29±14试验组 30 364±19 226±27 62±22**

3 讨 论

血管内皮细胞具有防止血液凝固和血栓形成的作用,并且内皮愈合能够减轻吻合口内膜增生程度。人工血管腔面内皮细胞种植和早期快速内皮化有利于维持管腔通畅[2]。但是由于种植的内皮细胞黏附性差,容易被血流冲脱,实际应用效果不佳[3]。因此,提高内皮细胞的粘附性有着重要意义,目前主要途径有:(1)预衬纤维结合素等细胞外基质[4];(2)人工血管表面进行化学修饰,掺入RGD等特异性的细胞附着肽链序列[5]。这些方法显示了一定的作用,但效果欠佳,不能普遍应用。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种广泛存在于人体各种组织中的生物活性物质。它被认为是血管生成刺激物、成纤维细胞增殖趋化因子、成肌细胞、角膜细胞、神经细胞生长的刺激物等。除了能促进内皮细胞在细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)上粘附和转移外,bFGF还具有促进内皮细胞增殖、促进内皮细胞合成ECM成分以及趋化等作用,从而有利于细胞的附着固定[6]。

本研究在内皮细胞种植前,先用bFGF溶液预衬处理人工血管,以提高内皮细胞的粘附性和保存率。由于体内血管中血流方式复杂,呈脉冲性层性流动、涡流和2次流等,对血管壁的作用很大,因此对于观察内皮细胞在人工血管中的粘附性是否提高有更实际的意义。本实验将种植内皮细胞后的两组人工血管分别植入兔腹主动脉,模仿人体血流的生理状态,分析比较在复杂的血流切力作用下,bFGF预衬处理提高内皮细胞保存率的情况。

结果显示,未用bFGF处理的对照组,无论是种植细胞密度还是在兔腹主动脉血流作用下的细胞保存率均低于bFGF预衬处理组,故bFGF预衬处理人工血管不仅可以明显提高初期的种植效果,提高静态培养条件下人工血管壁的内皮细胞密度,而且可以提高脉冲灌注情况下EC的保存率。

有研究表明,bFGF还能逆转缺氧导致的内皮细胞增殖能力下降[7]。因此,在种植细胞过程中更有效的保证了内皮细胞的增殖和分化,从而有利于内皮细胞在血管表面的均匀分布。血液流动产生的流体剪切应力影响内皮细胞的形态和功能,内皮细胞可通过形态变化、相关细胞粘附分子基因表达及纤维产生等反应,以承受高剪切应力的需要[5]。本实验中bFGF预处理提高内皮细胞在人工血管上的粘附性,其机制可能是上调了β1整合素,该整合素通过介导内皮细胞间的连接和内皮细胞与细胞外基质间的信号导以及作为一种细胞表面手提介导内皮细胞与ECM的粘附,从而使细胞牢固附着在基底膜上,耐受血流切应力的冲击[8-9]。

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