周文佳， 王 蒙， 黄 明， 华雯妍， 张全英

(苏州大学附属第二医院Ⅰ期临床试验研究室，江苏苏州215004)

福辛普利是唯一含次磷酸基团的血管紧张素转换酶抑制剂，主要用于治疗高血压、心力衰竭等疾病，由于可经肝、肾双途径清除，安全性好，故近年来其在临床上的应用及相关研究日益增多。福辛普利为酯类前药，本身对血管紧张素转换酶的抑制作用较弱，口服后在胃肠黏膜和肝脏迅速并完全水解为具有药理活性的代谢产物福辛普利拉，后者通过其次磷酸基团与血管紧张素转换酶活性部位中锌离子结合，从而抑制血管紧张素转换酶活性［1］。虽然已有文献报道福辛普利拉的血药浓度测定方法，但其样本处理大多采用液－液萃取法［2-3］或固相萃取法［4］，繁琐耗时。本文则采用简便、快速、低耗的甲醇直接沉淀蛋白法处理血浆样本，并建立LC-MS/ MS法测定福辛普利拉血药浓度，考察福辛普利钠片经中国健康志愿者口服后的药动学特性。

1 材料

1.1 药品与试剂

福辛普利钠片(蒙诺®，规格:10 mg/片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号:1007090);福辛普利拉对照品(含量:99.8%，浙江华海药业股份有限公司，批号:20100315);瑞巴派特(内标，含量: 99.9%，苏州天马医药集团天吉生物制药，批号: 0180606003)。甲醇为色谱纯，氨水和醋酸铵为分析纯，水为去离子水。

1.2 仪器

API-4000型三重四极杆串联质谱仪(美国AB公司)，数据处理系统为Analyst 1.4.2;Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱:WATERS XTerra®RP18柱(150 mm×4.6 mm，5μm);柱温:48℃;流动相:6 mmoL·L－1醋酸铵水溶液(用氨水调节至 pH10.2)－甲醇(57∶43);流速:1.0 mL·min－1;进样量:40μL。

2.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI);负离子电离模式;多反应监测;撞气压力:8 psi(1 psi=6.895 kPa);气帘气压力:25 psi;源内气体1压力:70 psi，气体2压力: 60 psi;电喷雾电压:－4 500 V;离子源温度:750℃。检测离子:福辛普利拉离子(m/z:434.2→236.9)，去簇电压:－70 V，碰撞能量:－29 V;内标离子(m/z:369.0→169.9)，去簇电压:－55 V，碰撞能量:－27 V。

2.3 血浆样本处理及测定

精密吸取血浆样本200μL至1.5 mL塑料离心管中，加入内标工作液(1.000 mg·L－1，用甲醇配制)50μL，涡旋混匀，加入甲醇500μL，涡旋1min，沉淀蛋白，于4℃、16 000 r·min－1离心10 min，精密吸取上清液100μL至进样瓶中，加入水相100μL，涡旋混匀，进样，进行LC-MS/MS分析。

2.4 临床试验方案

20名中国健康男性志愿者，体重(64.9±6.8)kg，身高(172.9±5.6)cm，年龄(24±2)岁，经体检合格后参加试验，并签署知情同意书。本试验方案经苏州大学附属第二医院伦理委员会审批通过。受试者在试验前2周及试验期间未服用其他任何药物，试验期间统一饮食。受试者服药前一天禁食过夜(约10 h)，试验开始当天早晨空腹口服福辛普利钠片10 mg，于服药前和服药后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0、24.0、36.0、48.0 h由肘静脉取血样3 mL置肝素化离心试管中，混匀，4 000 r·min－1离心5 min，分离所得血浆于－30℃冷冻保存待测。采用DAS2.0软件处理血药浓度－时间数据，计算药动学参数。

3 结果

3.1 方法学评价

3.1.1 专属性 分别吸取空白血浆、加入福辛普利拉对照品和内标的空白血浆以及加入内标的受试者服药后血浆样本，按“2.3”项下方法处理并进样，记录色谱图(见图1)。

图1 LC-MS/MS专属性试验色谱图Figure 1 Chromatograms of LC-MS/MS specificity test

由图1可见，福辛普利拉和内标的保留时间分别约为3.5和2.6 min，且峰形良好，血浆样本测定无杂质干扰。

3.1.2 标准曲线及最低定量限 精密吸取20μL不同质量浓度的福辛普利拉标准溶液(以甲醇为溶剂，用福辛普利拉对照品配制)至1.5 mL塑料离心管中，以氮气吹干，精密加入200μL空白血浆，涡旋混匀，配制成福辛普利拉质量浓度分别为0.500 5、1.502、5.005、15.02、50.05、150.2、300.3μg·L－1的标准含药血浆，按“2.3”项下方法处理并进样，记录色谱图。以福辛普利拉峰面积(As)和内标峰面积(Ai)的比值f(As/Ai)对福辛普利拉血药浓度(C)进行权重回归，得回归方程:f= 0.006 17×C+0.000 389，r=999 9，权重系数为1/C2。结果表明，福辛普利拉血药浓度在0.500 5～300.3μg·L－1范围内线性关系良好，最低定量限为0.5μg·L－1(RSD=5.3%，n=6)。

3.1.3 精密度和准确度 按“3.1.2”项下方法制备福辛普利拉质量浓度分别为 1.201、24.02、240.2μg·L－1的标准含药血浆，每个浓度平行5份，按“2.3”项下方法处理并测定，每天1批，连续测定3批，同时制备随行标准曲线。用excel软件对所测数据进行单因素方差分析，计算批内和批间精密度(RSD)以及准确度［相对偏差(RE)］，结果显示方法精密度和准确度良好(见表1)。

表1 血浆中福辛普利拉检测的精密度和准确度试验结果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

表1 血浆中福辛普利拉检测的精密度和准确度试验结果(±s，n=15)Table1 Result of precision and accuracy test for fosinoprilat in human plasma

加入量/ __μg·L－1测得量/ μg·L－1批内RSD/ %批间RSD/ % RE/ % 1.201 1.188±0.041 3.6 2.2 －1.1 24.02 23.47±0.67 1.6 6.4 －2.3 __240.2_____224.7±12.5______________________________ 2.713.2_－6.5

3.1.4 提取回收率 按“3.1.2”项下方法制备福辛普利拉质量浓度分别为1.201、24.02、240.2 μg·L－1的标准含药血浆，并按“2.3”项下方法处理;另取空白血浆200μL至1.5 mL塑料离心管中，共3份，均加入甲醇500μL，涡旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1离心10 min，取尽上清液，并在上清液中加入福辛普利拉对照品和内标，使溶解，涡旋混匀，分别制得同上3个质量浓度的福辛普利拉+内标溶液，精密吸取100μL至进样瓶中，加入100μL水相，混匀。以上两种方法制得并处理的样液每个浓度平行6份，分别进样测定，以两种方法所获同浓度样液的峰面积比值计算提取回收率。结果测得，血浆中低、中、高3个质量浓度的福辛普利拉的提取回收率分别为(96.0± 5.7)%、(89.3±2.6)%和(89.4±2.3)%，内标的提取回收率为(92.3±3.0)%。

3.1.5 基质效应 精密吸取6个不同来源的空白血浆各200μL分别至1.5 mL塑料离心管中，均加入甲醇500μL，涡旋1 min，于4℃、16 000 r·min－1离心10 min，取上清液600μL作为血浆基质;另取去离子水200μL至1.5 mL塑料离心管中，同法处理得对照基质。分别取血浆基质和对照基质，均加入福辛普利拉对照品和内标，使溶解，涡旋混匀，制得同上3个质量浓度的福辛普利拉+内标样液，精密吸取100μL至进样瓶中，加入100μL水相，混匀。以上两种样液每个浓度平行6份，分别进样测定，以同浓度的两种样液的峰面积比值计算基质效应。结果测得，血浆中低、中、高3个质量浓度的福辛普利拉的基质效应分别为(93.0± 5.0)%、(93.1±9.7)%和(94.0±8.7)%，内标的基质效应为(93.7±5.2)%。

3.1.6 稳定性 按“3.1.2”项下方法制备福辛普利拉质量浓度分别为1.201、24.02、240.2μg·L－1的标准含药血浆，分别于室温放置4 h、－30℃反复冻融3次及－30℃保存至19 d，再按“2.3”项下方法处理并进样测定，或将处理后的含药血浆样本(即上清液)在自动进样器于8℃放置15 h或福辛普利拉标准溶液于－40℃冷冻15 d后再进样测定。结果测得经以上不同处置的各样本中福辛普利拉含量均无明显变化，表明福辛普利拉的甲醇溶液及血浆样本稳定性良好。

3.2 药动学评价

按“2.4”项下方案，20名健康受试者口服福辛普利钠片后，在各时间点采集血样，分离血浆，再按“2.3”项下方法处理并进样，测得福辛普利拉血药浓度，绘制平均血药浓度－时间曲线(见图2);且发现福辛普利拉在体内的经时过程符合二房室模型，其主要药动学参数与文献报道［3，5］基本一致:Cmax为(148.4±43.9)μg·L－1，Tmax为(4.05±0.76)h，AUC0-48h为(1 315±342)μg·h·L－1，AUC0-∞为(1 335±341)μg·h·L－1，CL/F(清除率)为(7.957± 1.969)L·h－1，Vd(表观分布容积)为(103.9± 41.2)L，t1/2为(8.94±2.62)h。

图2 福辛普利拉的平均血药浓度－时间曲线(±s，n=20)Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of fosinoprilat

4 讨论

福辛普利拉结构中含有次磷酸基、氨基和羧基，因此流动相的pH值对其色谱行为至关重要。色谱试验发现，当水相pH小于7时，福辛普利拉吸附在色谱系统中，甚至无法洗脱;当水相pH大于7而小于10时，福辛普利拉峰形差，灵敏度低，重现性差;而当水相pH大于10时，福辛普利拉可获得较好的色谱峰形，并可使次磷酸基和羧基充分解离，避免氨基带正电荷，有利于负离子的生成，提高响应。但采用pH大于10的纯水相系统时，福辛普利拉在色谱柱上几乎无保留，因此需向水相中添加醋酸铵，以增加其在色谱柱上的保留，从而有利于其与血浆中内源性杂质分离，减小基质效应，同时醋酸铵可与氨水形成缓冲盐，保持色谱系统的稳定性。由于只有在极端的碱性条件下才能避免ESI离子源的不锈钢表面对磷酸盐化合物的吸附［6］，因此本文选用了WATERSXTerra®RP18色谱柱，从而保证色谱系统在pH1～12范围内的稳定性和耐用性，且该色谱柱具有内嵌极性基团的固定相，分析时可在固定相的表面形成水层，而水屏蔽层能够掩蔽解离后带负电的硅羟基，可有效阻止含氮化合物与硅胶表面残留硅羟基间的作用，减少拖尾现象发生［7］。

基质是指生物样本中除待分析物以外的一切组成，包括蛋白、磷脂及其他内源性物质。本实验中，由于对血浆样本的处理采用了蛋白直接沉淀法，因此在基质效应试验中，不同于一般液－液提取法所采用的流动相溶解对照品或提取挥干的血浆样本残渣的方法，而是将去离子水和空白血浆以相同的处理方法制备对照基质和血浆基质，然后分别加入福辛普利拉对照品和内标，再以水相配成近似于流动相的溶样环境后进样分析。这是因为，如果直接用流动相溶解对照样本，则与拟定的样本处理后的进样条件有所不同，而样本所处的溶样环境不同可能引起响应的差异，进而导致测定误差。本文基质效应试验的最后一步“精密吸取100μL该溶液至进样瓶中，加入100μL水相，混匀，进样”即是为了保证同时将血浆基质样本和对照样本配成近似于流动相的溶样环境，而又与拟定的样本处理方法相同。

本文建立的分析方法简便、准确、灵敏，适用于福辛普利钠片的临床药动学研究。

［1］ 王丽娟，王勇，金秀丽.血管紧张素转换酶抑制剂——福辛普利的药理与临床研究进展［J］.齐齐哈尔医学院学报，2001，22(9):1085-1086.

［2］ 李文艳，计家珠，郭继芬，等.中国健康志愿者口服福辛普利的药代动力学研究［J］.药学学报，2000，35 (8):601-604.

［3］ 崔双进，冯芳，马明，等.LC-MS/MS法测定人血浆中福辛普利及其活性代谢物福辛普利拉［J］.中国药科大学学报，2007，38(4):347-351.

［4］ Jemal M，Huang M，Mao Y，et al.Liquid chromatography/ electrospray tandem mass spectrometry method for the quantitation of fosinoprilat in human serum using automated 96-well solid-phase extraction for sample preparation［J］.Rapid Commun Mass Spectrom，2000，14(12): 1023-1028.

［5］ 罗金文，郑国钢，李会林.液质联用法快速测定人血浆福辛普利拉浓度［J］.医药导报，2010，29(9): 1129-1132.

［6］ Tuytten R，Lemiere F，Witters E，etal.Stainless steel electrospray probe:a dead end for phosphorylated organic compound?［J］.J Chromatogr A，2006，1104(1/2): 209-221.

［7］ 孙毓庆.现代色谱法及其在药物分析中的应用［M］.北京:科学出版社，2005:180-181.