裴晋红，柴文林，郭改娥，曹燕飞，汪军梅，栗学清

(1.长治医学院 生物化学教研室，山西 长治 046000;2.长治医学院 附属和济医院，山西 长治 046011)

p73是p53家族中第一个新成员，由Kaghad等于1997年首先发现，其染色体定位为1p36.2-3区。p73基因编码的蛋白质无论在结构上还是在功能上均与p53蛋白相似，且与肿瘤的发生密切相关。与p53基因不同的是，p73基因在人类大多数肿瘤中很少突变。目前许多资料表明，p73基因在许多肿瘤中均因异常甲基化而失活。本实验旨在探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)对非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma，NHL)p73基因甲基化的逆转作用，从而为该疾病的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

Taq DNA聚合酶、λDNA HindⅢ Marker购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa);MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、无 RNA酶的 DNaseⅠ购自Roche公司;100 bp DNA ladder Marker购自MBI公司;一抗:p73兔抗人单抗、β-actin小鼠抗人单抗以及二抗:山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG均购自Santa Cruz公司。

DNA回收纯化试剂盒(Wizard Clean-up System)购自Promega;DNA提取试剂盒购自Gentra公司。

所用引物均由广州Invitrogen公司合成。

PCR仪，英国Tech gene公司;凝胶扫描成像系统，美国Syngene公司。

1.2 研究对象

24例NHL标本，年龄在22～58岁之间，平均年龄为40岁，其中男性15例，女性9例。12例反应性增生淋巴结样本，年龄为15～48岁，平均年龄为31.5岁，其中男性8例，女性4例。以上样本均采自湖南省肿瘤医院。22例正常人外周血样本，男性10例，女性12例，采自中南大学湘雅三医院。

1.3 p73基因启动子的甲基化分析

用液氮研磨淋巴结组织，提取DNA，亚硫酸氢盐处理DNA后，再用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测p73基因外显子1的甲基化状况。甲基化产物的特异引物序列为:上游5'-GGA CGT AGC GAA ATC GGG GTT C-3';下游 5'-CGT CGC AAC CCC GAA CAT CG-3'。扩增片段大小67 bp。非甲基化产物的特异引物序列为:上游5'-AGG GGA TGT AGT GAA ATT GGG GTT T-3';下游 5'-CCA TCA CAA CCC CAA ACA TCA-3'，扩增片段大小 72 bp。PCR反应条件为:94℃变性2 min，94℃、30 s，60～55 ℃、30 s(每次循环降低 0.5℃)，72 ℃、30 s，10个循环，退火温度55℃再循环30次，最后72℃延伸10 min。取 PCR产物10 μL，3%琼脂糖凝胶电泳，电压:120 V，时间:30 ～60 min，浓度为 0.5 μg/mL的EB染色，以100 bp DNA ladder为标准，凝胶成像系统扫描成像并分析结果。

1.4 原代细胞培养和5-氮-2'-脱氧胞苷处理后p73 mRNA表达情况检测

将淋巴结组织在无菌条件下用含抗生素(500 u/mL青霉素和500 μg/mL链霉素)的Hank's液冲洗、剪碎，加细胞分离液分离细胞后进行原代细胞培养。将原代培养的NHL细胞以2×105个/mL的密度传代，24 h后分别加入终浓度为0(对照)，4及8 μmol/L的5-氮-2'-脱氧胞苷进行处理。每隔24 h更换新的培养基，并重新加药一次。连续处理3次，最后一次处理后24 h收集细胞，提取RNA，取RNA 2.0 μg反转录合成 cDNA，以 cDNA为模板进行PCR扩增。p73 mRNA引物序列:上游5'-GAC GGA ATT CAC CAC CAT CCT-3';下游5'-CCA GGC TCT CTT TCA GCT TCA-3'。扩增片段389 bp。PCR反应条件为:95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72℃、30 s，共循环35次;72℃延伸10 min。

取PCR产物5 μL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，120 V，30～60 min，EB 染色，以100 bp DNA ladder为标准，凝胶成像系统扫描成像并分析结果。

1.5 统计学处理

NHL患者和对照组p73基因甲基化情况比较采用统计软件程序SPSS10.0进行Chi-square test分析，P＜0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲基化结果

用MSP方法对24例NHL，反应性增生淋巴结及正常人外周血单个核细胞p73基因启动子的甲基化进行检测，取产物10 μL，3.0%琼脂糖凝胶电泳(EB染色)，于凝胶扫描成像系统中观察结果。24例NHL中21例发生甲基化，甲基化阳性率为87.5%，12例反应性增生淋巴结及22例正常人外周血淋巴细胞均未出现甲基化(见图1～3)。用Chisquare test方法，对24例初诊NHL的淋巴结组织、12例反应性增生淋巴结组织及22例正常人外周血单个核细胞p73基因的甲基化情况进行统计学分析，病例组和正常人比较，结果有显著性差异(P＜0.01)，表明p73基因在NHL中甲基化频率显著增高。

图1 NHL MSP产物琼脂糖凝胶电泳图

图2 反应性增生MSP产物琼脂糖凝胶电泳图

图3 正常人外周血单个核细胞MSP产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 5-氮-2'-脱氧胞苷处理后p73基因表达水平检测结果

取部分p73基因阴性表达的NHL组织细胞进行原代培养，经5-氮-2'-脱氧胞苷处理后，用 RTPCR检测p73基因的表达，结果表明，p73基因恢复表达(见图4)。

3 讨论

p73是p53家族新成员，它和p53家族的其他成员一样，处于相互联系的信号网络系统的中心位置，在正常生理活动和肿瘤的发生过程中调节细胞的增殖、分化和细胞的死亡。p73基因的异常表达可引起肿瘤发生，它和人类许多肿瘤的发生密切相关，因此，p73是重要的肿瘤生物治疗靶标。

图4 5'-Aza-dc处理后非霍奇金淋巴瘤p73基因mRNA的表达

p73基因可产生多种蛋白质异构体，这些蛋白质异构体是由于启动子不同或外显子的不同拼接而产生，从功能上可分为 TAp73和△Np73两大类［1-2］。TAp73是肿瘤抑制基因，由P1启动子启动而产生。△Np73是促癌基因，它是N-末端截断了的p73转录本。现在普遍认为，TAp73和△Np73的平衡调控细胞对于凋亡的敏感性［3］，当p73基因异常表达时肿瘤易于发生。

目前已有资料表明，基因CpG岛的异常甲基化易导致人类多种疾病的发生和发展，特别在肿瘤的形成过程中起重要作用。据已有资料估算，有数百个基因因甲基化而沉默。如在胃癌的研究中发现p16基因因启动子区的高甲基化而沉默，并得出p16基因因启动子区的异常甲基化可能是胃癌发病的机制之一［3］。p73基因由于P1启动子的高甲基化而使p73基因表达下调，进而引起肿瘤发生。在急性白血病中p73基因的甲基化改变最为频繁［4-6］。在急性淋巴细胞性白血病中，癌相关基因的甲基化是造成基因失活的最重要的方式［7］。在恶性淋巴瘤中p73基因由于甲基化而沉默［1］。NHL是恶性淋巴瘤的一大类型，在我国，恶性淋巴瘤中NHL所占的比例远高于霍奇金病。很多国家NHL的发病率有一定增高趋势，目前其发病原因尚不清楚。已有文献报到，p73基因表达与p73基因启动子的甲基化呈显著负相关［8］;p73基因启动子的甲基化可能是造成p73基因表达下调进而导致NHL发病的原因之一。

相对于DNA的突变，DNA甲基化可被DNA甲基化抑制剂作用而逆转。DNA甲基化抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷是一种天然的脱氧胞苷酸的腺嘌呤核苷类似物，它通过抑制DNA甲基化转移酶活性来恢复抑癌基因的功能，从而达到肿瘤治疗的目的。有研究表明，5-氮-2'-脱氧胞苷对急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病等具有重要的临床治疗意义。

NHL发病率高，在临床治疗过程中容易产生耐药，目前仍然缺乏有效的治疗手段和治疗药物。本实验用MSP方法对24例NHL p73基因启动子的甲基化进行检测，用5-氮-2'-脱氧胞苷处理部分NHL原代培养细胞后，检测p73mRNA表达情况。结果表明p73基因启动子的甲基化可被5-氮-2'-脱氧胞苷逆转，导致因甲基化而被抑制的p73基因表达上调。

总之，启动子区高甲基化引起的抑癌基因失活为肿瘤研究领域带来了新的发现，也为肿瘤的诊断、治疗及预后带来了新的思路。去甲基化试剂5-氮-2'-脱氧胞苷在临床上已有应用［9］。尽管目前在临床治疗过程中还存在一些问题，但去甲基化药物的应用有望将肿瘤的治疗带入一个新的领域。

(此课题在中南大学完成)

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