赵 婷，杨 阳，宋新蕾，黄晓婧，王凤山，2

(1.山东大学 药学院生化与生物技术药物研究所，2.国家糖工程技术研究中心，山东 济南 250012)

血容量不足常常引起低血压、器官血流灌注不足，进而引起多器官功能障碍，乃至威胁生命［1］。目前，临床上针对低血容量症的治疗手段主要是采用血容量扩充药进行复苏，常将人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)作为一线容量扩充剂。然而，HSA的临床应用存在一定局限性，如在感染、外伤或手术等病理情况下，炎性级联反应释放出大量炎性介质，引起血管内表皮细胞损伤，毛细血管通透性增加，从而加速HSA泄漏，引起组织水肿和灌注下降，使病情恶化［2-3］。

此外，血液来源紧张等原因致使HSA的供应十分紧张，如何解决当前HSA紧缺的问题成为目前研究的一个热点。许多科研工作者尝试采用基因重组技术生产白蛋白(rocombinant HSA，rHSA)［4-5］，但是由于HSA临床应用剂量较大和重组蛋白产率较低等原因，实现高纯度、低成本的药用级rHSA的大规模生产是个极具挑战性的课题［6］。目前，就血容量扩充药这一用途来讲，HSA的主要来源仍然是人血浆。

针对以上HSA在某些病理情况下大量输注血管保留率低，易在血管外池敏感组织聚集，从而引起或加重组织水肿及来源短缺等问题，我们设想采用聚乙二醇(PEG)对HSA进行共价修饰。PEG分子具有巨大的水化体积，与HSA偶联后将赋予HSA较大的分子半径，从而减少血管渗漏，增加外源性输注的HSA的血管保留率，使其充分发挥血容量扩充作用;同时PEG修饰能显著改善蛋白质药物的药代动力学性质［7］，对HSA进行PEG修饰有望延长其生物半衰期，降低用药频率，在药物经济学方面也具有一定意义。

本实验对以上设想进行了初步验证，采用氰尿酰氯活化的PEG对HSA进行修饰，圆二色谱法测定HSA及其PEG修饰产物(PEG-HSA)的二级结构，同时采用脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型，考察HSA和PEG-HSA的肺毛细血管渗透性;另外，采用同位素示踪法研究了PEG-HSA的药代动力学性质。

1 材料

HSA，山东泰邦生物制品有限公司;PEG6000，上海生工生物工程有限公司;LPS、异硫氰酸荧光素(FITC)，Sigma公司;DEAE Sepharose FF，GE 公司;Na125I，中国原子能科学研究院。

Chirascan圆二色谱仪，英国应用光物理公司;AKTA Purifier100蛋白色谱系统，美国 GE公司;IX51倒置荧光显微镜，日本Olympus公司;WIZARD Gamma全自动计数仪，美国PE公司。

昆明种小鼠，山东大学实验动物中心提供，许可证号:SCXK(鲁)20090001。

2 方法

2.1 HSA的PEG修饰物的制备

将氰尿酰氯活化的PEG6000与HSA按摩尔比10∶1溶于pH 9.0、10 mmol/L的四硼酸钠缓冲液中，4℃缓慢搅拌反应10 h，加入过量的甘氨酸终止反应。修饰反应混合物经适当稀释后进行SDS-PAGE分析。

2.2 PEG-HSA的分离纯化

采用阴离子交换色谱法(DEAE Sepharose FF)和超滤法分离纯化修饰产物。

修饰反应液1 mL加平衡缓冲液5 mL稀释，0.45 m微孔滤膜过滤后上样。分离参数为:流速:5.0 mL/min;上样体积:5 mL;平衡液:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 6.5;洗脱条件:0.1～0.3 mol/L NaCl线性梯度洗脱;检测波长:280 nm。修饰混合物经DEAE Sepharose FF分离洗脱时出现两个完全分开的洗脱峰，收集洗脱峰，超滤脱盐，SDS-PAGE检测纯度。

2.3 二级结构测定

采用圆二色谱法测定HSA和PEG-HSA的二级结构。分别称取适量 HSA和 PEG-HSA，溶于pH 7.4，50 mmol/L磷酸盐缓冲液中，使其蛋白终浓度均为 5 μmol/L［8］。所用比色池光程为 0.1 cm，谱带宽度为1 nm，扫描时间为1 s，室温下分别测定HSA和PEG-HSA在190～260 nm波长范围内的圆二光谱。

2.4 急性肺损伤模型中的血管渗透性

采用LPS诱导的急性肺损伤为模型，考察HSA和PEG-HSA在肺部毛细血管的渗出。首先对HSA和PEG-HSA进行FITC荧光标记［9］。将昆明小鼠随机分为3组:对照组(生理盐水+FITC-HSA)、HSA给药的模型组(LPS+FITC-HSA)和PEG-HSA给药的模型组(LPS+FITC-PEG-HSA)，每组4只。小鼠水合氯醛麻醉，LPS的生理盐水溶液(0.2 mg/mL)50 μL滴鼻给药诱导急性肺损伤模型，对照组给生理盐水50 μL。LPS或生理盐水滴鼻20 min后尾静脉注射FITC标记蛋白(0.42 mg/kg)。LPS造模后4 h，麻醉小鼠，打开胸腔，剪开右心耳，向左心室内灌注生理盐水，直至右心耳流出清亮液体为止，再灌注10%甲醛固定。取肺组织，冰冻切片，荧光显微镜观察FITC标记的HSA和PEG-HSA在肺组织的分布。

2.5 小鼠体内的药代动力学研究

2.5.1 HSA和PEG-HSA的125I放射性标记及分离纯化 采用Iodogen法对蛋白进行放射性碘标记。取涂布好的Iodogen管放置到室温，于管底加入pH 7.4、0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液 100 μL，而后加入PEG-HSA(8 mg/mL)或 HSA(5 mg/mL)10 μL，迅速于铅盒内取Na125I 2.5 μL加入反应管中，轻轻振摇，待室温反应20 min后，加入pH 7.4、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液150 μL，混匀，静置10 min以终止碘化反应。

将Sephadex G-25色谱柱(1.1 cm×27 cm)预先用pH 7.4、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液平衡，上样后洗脱流速0.3 mL/min，每管收集1 mL。分别取各收集管内洗脱液10 μL，置于γ-能谱仪中测定各管的放射性计数(cpm)，绘制放射性色谱分离曲线。收集蛋白峰，将收集的碘标产物置于4℃备用。

2.5.2 HSA和PEG-HSA在小鼠体内药代动力学和组织分布研究 雄性昆明种小鼠84只，按体重随机分为2组，分别为HSA组和PEG-HSA组。每只小鼠快速尾静脉注射给药100 μL(370 kBq)，给药后5，20，45 min，1，4，8，12，24，36，48，60，72，84，96 h(14个时间点)眼眶取血0.1 mL，10%三氯乙酸沉淀，2 000 r/min离心10 min，取沉淀于 γ-能谱仪上测定放射性，记录结果，计算血药浓度，使用药代动力学软件3p97计算药物体内半衰期等药代动力学参数，同时计算每1 mL血液放射性占注射剂量的百分比，绘制给药时间对血浆蛋白水平曲线。

将时间点1，4，12和24 h的小鼠脱臼处死，解剖取心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪等组织，生理盐水冲洗，称重并测定放射性，计算每1 g组织放射性占注射剂量的百分比，比较不同组织中HSA和PEGHSA的分布情况。

3 结果

3.1 HSA的PEG修饰产物的制备

HSA与PEG偶联反应混合物进行SDS-PAGE分析，检测产物分布，结果见图1。未修饰HSA，呈单一条带;修饰反应混合物在HSA条带上方出现了新条带，分子质量分布较为广泛。修饰混合物经阴离子交换色谱和超滤进行分离纯化，可将未反应HSA和PEG修饰剂除去，获得PEG-HSA。

3.2 HSA和PEG-HSA的二级结构

HSA和PEG-HSA的圆二色谱见图2。可见，HSA与PEG-HSA具有类似的峰形，两者的几乎重合，这说明两者的二级结构几乎一致，提示PEG修饰并未影响HSA的二级结构，较好的保持了HSA分子的结构。蛋白质的二级结构是活性的基础，由此可进一步推断修饰反应及后续的分纯化等过程不会影响蛋白的生物活性。

图2 HSA及其PEG修饰产物的远紫外圆二色谱图Fig.2 Far-UV CD spectra of HSA and PEG-HSA

3.3 HSA和PEG-HSA的肺毛细血管渗透性

图3为各实验组肺组织的荧光显微照片。可见，HSA给药模型组的荧光强度明显高于对照组，即该组FITC-HSA的渗出量高于对照组，此结果提示LPS诱导的急性肺损伤能够引起肺组织毛细血管通透性增加，造模成功。同时可以观察到PEGHSA给药组的荧光强度明显低于HSA给药组，PEG-HSA穿透肺毛细血管渗漏进入组织的量低于HSA给药组。以上结果提示在毛细血管通透性增加的情况下，PEG修饰能减少HSA透过血管内皮渗出进入组织间隙。

3.4 HSA和PEG-HSA的药代动力学和组织分布

图4为HSA和PEG-HSA小鼠尾静脉注射后血浆水平的时间曲线。由图4可见，HSA和PEG-HSA经尾静脉注射后血浆水平都成指数下降，与HSA相比，PEG-HSA的消除速率较慢。根据赤池信息判据最小原则(Akaike's Information Criterion，AIC)进行房室模型判别，结果表明小鼠尾静脉注射给药HSA和PEG-HSA符合二室模型。按照二室模型法进行拟合得出的主要药代动力学参数见表1，其中HSA的消除半衰期(t1/2β)为(10.31±0.43)h，而 PEGHSA的t1/2β为(22.93±1.51)h，延长为未修饰前的2.2倍左右，PEG-HSA的药时曲线下面积(AUC)和平均保留时间(MRT)都较未修饰前增大，另外，总体清除率也有所降低。以上结果均提示PEG修饰能够改善HSA在体循环的保留率。

图3 LPS诱导的急性肺损伤模型中HSA和PEG-HSA的肺毛细血管渗透性Fig.3 Pulmonary microvascular permeability of HSA and PEG-HSA in acute lung injury mice

图4 125I-HSA和125I-PEG-HSA尾静脉注射小鼠后标记蛋白的血浆水平Fig.4 Plasma level of radiolabeled proteins after a single intravenous administration of125I-HSA or125I-PEG-HSA to normal mice

表1 小鼠尾静脉注射HSA与PEG-HSA的体内药代动力学参数(±s)Tab.1 Pharmacokinetic parameters following a single iv bolus injection of125I-HSA or125I-PEG-HSA to mice(±s)

表1 小鼠尾静脉注射HSA与PEG-HSA的体内药代动力学参数(±s)Tab.1 Pharmacokinetic parameters following a single iv bolus injection of125I-HSA or125I-PEG-HSA to mice(±s)

与HSA比较:1P＜0.05，2P＜0.011P＜ 0.05，2P＜ 0.01 vs HSA

参数HSA PEG-HSA AUC/(μg·h/mL) 2.79±0.09 10.07±1.192 t1/2α/h 0.171 ±0.08 3.57±0.342 t1/2β/h 10.31 ±0.43 22.93 ±1.512 CL/(mL/h) 0.39±0.03 0.14±0.012 MRT/h 22.62±0.82 32.13±1.581 Vdss/mL 5.62±0.12 4.12±0.512

HSA与PEG-HSA小鼠体内组织分布结果图5。从整体趋势上看，PEG-HSA并未显示明显的组织分布特异性，即HSA在修饰后其组织分布特点并未发生明显变化，说明PEG修饰并未影响HSA的组织分布规律。

图5 HSA和PEG-HSA小鼠尾静脉注射后1，4，12和24 h的组织分布图Fig.5 Tissue distribution of HSA and PEG-HSA at 1，4，12，and 24 h time points in normal mice after a single intravenous administration

4 讨论

HSA是一个含585个氨基酸残基的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5 kD，是血浆中最丰富的蛋白质成分，约占血浆总蛋白的60%。HSA具有重要的生理功能，是维持血液胶体渗透压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体。

正常生理条件下，HSA分子在血管内和血管外均有分布，每天约有120～145 g HSA穿过血管内皮细胞间隙进入组织，而大部分HSA又能被淋巴循环吸收而返回到血液循环中。HSA可穿过血管内皮上半径为145 Å的小孔，因此HSA的血管透过率是由分子大小决定的。基于以上理论，本实验采用PEG对HSA进行共价偶联，利用PEG分子本身巨大的水化体积，增加HSA的分子半径，使得HSA不易透过血管内皮细胞间隙进入组织而保留在血循环中，即可以避免组织水肿的发生，又可以充分发挥HSA的扩充血容量的药效。同时，PEG修饰能延长蛋白质的t1/2，降低用药频率，进而缓解人血HSA来源紧缺的问题。

本实验为在较短时间内验证本课题设想，采用了反应容易进行的随机修饰策略，HSA分子含有59个赖氨酸，再加上N末端氨基酸，一个HSA分子有60个可与PEG反应的位点，因此导致获得的PEGHSA分子质量分布较为分散，产品质量难以控制。为了获得结构均一的修饰产物，以后的实验将尝试采用定点修饰策略对蛋白进行修饰。本实验采用圆二色谱测得HSA和PEG-HSA的二级结构几乎一致，提示PEG修饰反应及后期的分离纯化步骤并未影响HSA的二级结构。由此可进一步推断PEG修饰可能不会影响HSA的生物活性包括药物结合作用和血容量扩充作用等。

毛细血管通透性增加是急性肺损伤的重要病理特征，研究报道在LPS给药4 h时肺部毛细血管的通透性明显增加［9］，我们在LPS给药4 h后观察到PEG-HSA的渗出明显减少，提示PEG修饰能降低HSA的血管透过率，可能是由于PEG与HSA偶联后增大了蛋白分子的水化体积，使得HSA不易透过毛细血管内皮上的孔隙。

本研究通过同位素示踪法测得HSA经PEG修饰后t1/2延长为原来的2.2倍。HSA在人体内的天然t1/2为18～20 d，而外源性输注的HSA的t1/2则大大缩短。我们推断PEG-HSA的t1/2延长可能是由于PEG分子的遮蔽效应，阻碍了血管内皮表面膜清除剂受体与HSA的结合，从而减少了HSA的降解，使其具有较长的血管保留时间。

综上所述，通过PEG修饰的方法能够延长HSA的t1/2，降低HSA的血管透过性，进而增加其血管保留率，降低用药频率，在血管渗透性增加相关疾病的治疗方面PEG-HSA有望成为一种优良的新型血容量扩充剂。

［1］ Brun-Buisson C.The epidemiology of the systemic inflammatory response［J］.Intensive Care Med，2000，26(1):64-74.

［2］ Christ F，Gamble J，Garside I B，et al.Increased microvascular water permeability in patients with septic shock，assessed with venous congestion pletismography(VCP)［J］.Intensive Care Med，1998，24(1):18-27.

［3］ Nicholson J P，Wolmarans M R，Park G R.The role of albumin in critical illness［J］.Br J Anaesth，2000，85(4):599-610.

［4］ Fleer R，Yeh P，Amellal N，et al.Stable multicopy vectors for highlevel secretion of recombinant human serum albumin by Kluyveromyces yeasts［J］.Biotechnology，1991，9(10):968-975.

［5］ He Y，Ning T，Xie T，et al.Large-scale production of functional human serum albumin from transgenic rice seeds［J］.PNAS，2011，108(47):19078-19083.

［6］ Kobayashi K.Summary of recombinant human serum albumin development［J］.Biologicals，2006，34(1):55-59.

［7］ Bonora G M，Ivanova E，Zarytova V，et al.Synthesis and characterization of high-molecular mass polyethylene glycol-conjugated olionucleotides［J］.Bioconjug Chem，1997，8(6):793-797.

［8］ Matsushita S，Chuang V T，Kanazawa M，et al.Recombinant human serum albumin dimer has high blood circulation activity and low vascular permeability in comparison with native human serum albumin［J］.Pharm Res，2006，23(5):882-891.

［9］ Monsigny M，Roche A C，Midoux P.Uptake of neoglycoproteins via membrane lectin(s)of L1210 cells evidenced by quantitative flow cytofluorometry and drug targeting［J］.Biol Cell，1984，51(2):187-196.