刘 琳，谢志明

(辽宁医学院 附属第三医院 肾内科，辽宁 锦州 121000)

血管生成素(Angiopoietins，Ang)是一组内皮细胞特异性分泌型生长因子，1985年，Ang首次从人结肠癌细胞培养上清中被发现［1］，Ang的四种同分异构体之一的Ang-1与血管的形成密切相关［2］，且具有抑制内皮凋亡、促进内皮细胞出芽、稳定血管及降低血管通透性的作用［3］。近年来，其在小鼠肾脏胚胎血管发育以及人的肾脏功能调控方面的作用日益受到关注，但对小鼠肾脏发育中表达变化规律的研究目前国内报道较少。

本文观察了Ang-1在小鼠肾脏发育中的形态学变化，并应用免疫组织化学技术及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行了定性及定量观察，以探讨在小鼠肾脏发育中Ang-1的作用。

1 材料

Ang-1兔抗小鼠多克隆抗体、SABC试剂盒，武汉博士得生物制品公司。

Zeiss-A1显微镜和照相机(德国);MIVNT显微图像分析系统(中国)。

昆明系小鼠，辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK(辽)2003-2007。

2 方法

2.1 实验动物培养及取材

昆明系小鼠，以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄0 d。记录受孕时间。随后每日早8点和晚5点观察仔鼠出生情况，记录出生时间。取胚龄14，16，18 d 胎鼠和出生后 1，7，14，21 和 42 d 仔鼠，每组4只，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。分别取胎鼠及仔鼠的左右肾脏。左肾放入10%中性福尔马林溶液固定，右肾入液氮迅速冷冻，-80℃冰箱保存，留做Western blotting试验。

2.2 光镜标本制备

左肾经固定、冲洗、脱水，石蜡定向包埋，切片厚5 μm，部分切片HE染色，部分切片用于免疫组化染色，光镜下观察。

2.3 免疫组化检测Ang-1的表达

切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温10 min，0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0)中修复10 min，山羊血清封闭液 20 min(室温)，滴加 Ang-1一抗(1∶100)4℃过夜，加 SABC试剂孵育30 min，DAB显色8 min。苏木素复染，经脱水、透明、封片。

2.4 Ang-1组化表达强度的测定

图像用CISA-1000型细胞图像分析系统处理，每个动物肾脏随机选取7张切片，且每张切片随机选取7个阳性表达区域。以切片背景色为参照，灰度值越高，表明Ang-1含量越低。

2.5 Western blotting检测Ang-1的蛋白表达

取冷冻待用的右肾组织，加入4倍体积的细胞裂解液，0℃下剪碎、匀浆，静置30 min，4℃，12 000 r/min离心10 min，用Bradford法测定蛋白含量。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，取上述制备的样品，加到浓缩胶的样品孔，80 V电压下电泳，待指示剂达到分离胶时，将电压增加至120 V，常温下转印，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(稀释度为1∶500)4℃过夜，BCIP/NBT试剂显色，经扫描电泳条带，获得结果，用Gene Tool软件分析电泳条带光密度。

2.6 统计学分析

3 结果

3.1 光学显微镜观察结果

发育中肾小体可分5期:Ⅰ期为逗号小体;Ⅱ期为S小体;Ⅲ期为毛细血管袢期;Ⅳ期又称未成熟期;Ⅴ期即成熟肾小体。光学显微镜下观察到，胚龄14 d，肾脏已形成完整的被膜，且于肾被膜下可见大量早期肾小体，这部分皮质称为生肾区。胚龄16 d，肾脏皮质和髓质清晰可见，此时大部分肾小体仍为逗号小体和S小体，偶见Ⅳ和Ⅴ期肾小体，可见少量近直小管、远直小管和集合管构成，其间大量肾间质。胚龄18 d，髓放线出现。生后1 d，Ⅳ和Ⅴ期肾小体数量明显增加。生后7 d，只可见Ⅴ期肾小体。出生14 d后，肾脏体积增大，肾小体的体积也随之增大，大量成熟肾小体、肾小管出现。

3.2 免疫组化染色结果

3.2.1 Ang-1免疫组化染色结果 Ang-1在胚龄14 d的胎鼠肾脏开始出现表达，但表达微弱，部位在肾间质细胞。以后随着胚(日)龄的增加，表达逐渐增多且分布广泛，主要分布在肾小体、肾小管、肾间质以及肾血管中，生后14 d表达最为显著，以后表达逐渐减弱。

3.2.2 Ang-1免疫组化表达强度的测定 Ang-1在小鼠肾脏发育的不同时期均呈不同程度的表达，胚龄14，16 和18，生后1，7，14，21 和42 d 其灰度值依次为150.36±6.53，134.22±5.23，112.46±5.56，100.61 ±4.09，85.43 ±4.14，68.59 ±5.07，92.31 ±6.64和160.31±4.12，各时间灰度值和前一时间的灰度值比较，均有显著差异(P＜0.05)。见图1。

图1 小鼠肾脏发育不同时期Ang-1的灰度变化Fig.1 Gray of Ang-1 in different periods of mice kidney development

3.3 Western blotting结果

Ang-1和β-actin的分子质量分别为100和42 kb，以β-actin的吸光度值作为内参照，经校正，再进行半定量分析。结果随着时间的增加，Ang-1的蛋白含量增多，在生后21 d含量达到最高水平，此后开始逐渐下降。见图2。

图2 小鼠肾组织中Ang-1蛋白含量变化Fig.2 Ang-1 protein content changes in mice in renal tissue

4 讨论

Ang有四种同分异构体，即 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4。其中Ang-1与胚胎血管的生成以及成熟血管的构建与维持关系密切。以往实验发现，通过转基因方法使Ang-1或受体基因失活时，转基因小鼠胚胎则不能正常发育，而死于血管网络形成后的血管成形缺陷［4］。在Ang-1无义突变的小鼠胚胎中，血管内皮细胞聚集成团，并且与管周细胞及细胞外基质连接异常，提示Ang-1具有维持血管稳定性的作用［5］。此外，Ang-1还能够通过下调E-选择素基因表达，起到保持血管内皮层稳定的作用，降低了血管通透性［6］。我们应用免疫组化和Western blotting方法检测Ang-1在小鼠肾脏的表达，结果表明，Ang-1在胚龄14 d的胎鼠肾脏中开始出现表达，但表达微弱，部位在肾间质细胞。以后随着胚(日)龄的增加，表达逐渐增多且分布广泛，主要分布在肾小体、肾小管、肾间质以及肾血管中。研究表明，Ang-1对血管内皮细胞(VEC)有强大的调节作用，它对VEC有明显的趋化作用，可以介导内皮细胞趋化和迁移［7］。在Ang-1的作用下，VEC在迁移的同时可以出芽，这也是血管生成的基础［8］。而肾小球内皮细胞正是肾小体滤过屏障的重要组成部分。研究还发现，Ang-1可以抑制肾小体发育过程中内皮细胞的凋亡现象［9］，所以随着小鼠胚(日)龄的增加以及肾小体的发育，Ang-1的表达也逐渐增多，主要作用是介导内皮细胞的生存，拮抗内皮细胞凋亡，并调节血管内皮细胞之间及其细胞外基质的相互作用，从而促进内皮细胞形成肾小体血管结构，并且维持着成熟血管的稳定性。Ang-1同时也表达在肾小管。在肾脏发育过程中，大部分肾小管都有Ang-1mRNA表达，表明Ang-1的表达对肾间质血管的发育至关重要［10］。

哺乳动物的肾脏起源于输尿管芽及其诱导的生后肾组织。输尿管芽分化、发育为各级集合管，生后肾组织将发育为生肾区，并经过细胞集聚，发育为肾单位。我们观察到生后7 d生肾区消失，此时不再有新的肾单位产生，肾小体数目恒定，不再增加，而以单个肾小体体积增大为主。从血管球和肾小囊的比例来看，肾小囊所占的比例逐渐减少，而血管球所占的比例逐渐上升［11］。生后14 d，是肾脏的生长和成熟最明显的时期，此时Ang-1的水平最高。故可以推测Ang-1具有促进血管成熟、改建以及塑型的作用，尤其在维持血管的稳定性方面作用尤为显著。在成熟肾脏中，仍可见Ang-1在肾小体和间质血管的表达，说明血管成熟后，Ang-1仍然起着维持血管的完整性和稳定性的作用。因此，在肾脏发育的不同时期，Ang-1在肾脏表达部位及强度的不同，显示了Ang-1在肾脏发育过程中，参与了肾单位的形成和促进其成熟的作用，并调控和维持着正常肾小球滤过功能以及肾小管的回吸收功能。

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