蒋国红，黄良国，施迎兵

(遵义医学院附属医院神经内科，贵州遵义 563003)

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是人类的常见病和多发病，其以较高的发病率、致残率和病死率严重地影响着人类的健康。细胞凋亡是出血性颅脑损伤的重要机制之一[1]。胱天蛋白酶3(caspase-3)是目前已知的促凋亡蛋白，在细胞凋亡过程中起关键作用[2]；而热休克蛋白70(heat shock proteins 70，HSP70)则作为一种细胞内源性保护蛋白，发挥着抑制细胞凋亡的作用。本实验拟探讨白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)对这两种蛋白在脑出血大鼠脑内表达的影响，为临床治疗脑出血提供新思路。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康SD大鼠96只，清洁级，雌雄不拘，体质量250～300 g，由第三军医大学大坪医院动物中心提供[许可证号SCXK(渝)2007-0005]。实验大鼠随机分为正常组(N组，n=6)，模型组(M组，n=30)，IL-10低剂量组(L组，n=30)，IL-10高剂量组(H组，n=30)。除正常组外，其余各组分为造模后6 h、12 h、1 d、3 d及7 d 这5个时间点，每个时间点随机选择6只大鼠进行检测。

1.2主要仪器与试剂 大鼠脑立体定位仪(日本SETAGAYA-KU.TOKY)，图像处理显微镜(德国LEICA-DM 1000)，石蜡切片机(德国LEICA-RM-2145)，IL-10(英国PeproTech EC公司)，VII型胶原酶(美国Sigma BioScience公司)，caspase-3及HSP70试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3方法

1.2.1模型制备和给药方法 实验大鼠术前12 h禁食，4 h禁水，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪。局部消毒后“T”字形剪开颅顶皮肤，按《大鼠脑立体定位图谱》定位尾状核[3]，向大鼠右侧尾状核缓慢注入0.5 μL胶原酶，留针10 min后缓慢拨出穿刺针，缝合皮肤，局部消毒。待动物苏醒后，放回笼内饲养，给予正常进食进水，保持室温37 ℃左右。N组不做任何处理。其余各组造模成功后，M组术后3 h以1 mL生理盐水腹腔注射，以后每天1次； L组术后3 h将IL-10(5 μg/kg)加生理盐水至1 mL腹腔注射，以后每天1次；H组术后3 h将IL-10(30 μg/kg)加生理盐水至1 mL腹腔注射，以后每天1次。

1.2.2神经功能缺损评分 在各组相应时间点采用平衡木行走测试进行神经功能缺损评分[4]。该项目评分标准共分为6个等级。0分：大鼠能跳上平衡木并在上面移动而不会掉下； 1分：大鼠能跳上平衡木并在上面移动，掉下概率小于或等于50%；2分：大鼠能跳上平衡木并在上面移动，掉下概率大于50%；3分：在健侧肢体帮助下能跳上平衡木，但受累的瘫痪肢体不能帮助其向前移动；4分：大鼠在平衡木上不能移动，但不会掉下；5分：将大鼠放在平衡木上即会掉下。评分越高，神经功能缺损越重。

表1 M、L、H组大鼠不同时间点神经功能缺损评分比较分,n=6)

▲:P<0.01,与M组比较；☆:P<0.05,☆☆:P<0.01,与L组比较。

表2 各组不同时间点HSP70阳性细胞数表达比较个，n=6)

-：表示此项无数据；▲:P<0.01,与M组比较；☆:P<0.05,☆☆:P<0.01,与L组比较。

表3 各组不同时间点caspase-3阳性细胞数个，n=6)

-：表示此项无数据；▲：P<0.05,▲▲：P<0.01，与M组比较；☆☆:P<0.01,与L组比较。

1.2.3检测方法 在相应时间点用水合氯醛麻醉大鼠，快速断头取脑。沿穿刺针道冠状面自上向下切开至尾状核处，可见血肿灶。以穿刺点为中心，冠状面取厚度5 mm脑组织置于4%多聚甲醛液中固定4 h，脱水后石蜡包埋。以血肿灶为中心制作厚度为4 μm水平位脑组织切片待测。HSP70和caspase-3免疫组织化学染色严格按照说明书步骤进行。在高倍光镜下(×400)，每张切片计数血肿周边不重叠5个视野阳性细胞数，计算平均值。

2 结 果

2.1神经功能缺损评分 造模1、3、7 d 后，L组与H组大鼠神经功能缺损评分均明显低于M组(P<0.01)；造模1、3、7 d后，H组大鼠神经功能缺损评分明显低于较L组(P<0.05，P<0.01)。见表1。

2.2IL-10对血肿周围组织HSP70表达的影响 N组血肿周围组织HSP70表达很少，其余3组造模6 h后HSP70表达即有增加，造模1 d达高峰，之后逐渐下降，造模7 d后仍有较高表达。造模12 h及1、3、7 d后，H组HSP70表达高于L组及M组(P<0.05,P<0.01)。造模6、12 h后，L组HSP70表达与M组比较差异无统计学意义(P>0.05)；造模1、3、7后，L组HSP70表达明显高于M组(P<0.01)。见表2，封2图1～4。

2.3IL-10对血肿周围组织caspase-3表达的影响 caspase-3在N组表达很少，其余3组造模6 h后表达开始增加，造模1 d达高峰，之后逐渐下降。造模12 h后，H组与L组caspase-3表达水平均低于M组(P<0.05，P<0.01)；H组与L组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)；造模1、3、7 d后， D、L、H 3组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3，封2图5～8。

3 讨 论

IL-10是重要的炎症抑制因子，在体内存在多种活性。近年来研究表明IL-10参与了神经细胞凋亡过程[5]，可为神经损伤修复提供适宜的微环境[6]，具有神经保护作用[7]。既往研究多集中于缺血性脑血管病方面，对出血性颅脑损伤研究较少。颅脑出血后导致的损伤机制复杂，其组织损伤是多因素参与、多途径进行的复杂过程，目前仍缺乏有效的治疗方法。脑出血后会引起系统性的抗炎反应，诱导IL-10水平升高，对脑微循环起保护作用[8]，但应激产生的IL-10不足以抑制脑出血后继发炎症反应及凋亡的有害作用[4]。本研究通过应用外源性IL-10治疗脑出血大鼠，观察IL-10对HSP70、caspase-3表达的影响，探讨IL-10对出血性脑损伤的脑保护作用及其机制。

HSP是一个庞大的糖蛋白超基因家族，具有分子伴侣、调控细胞周期和参与应激等广泛的生物学功能，对缺血性损伤有保护作用[9]，其中HSP70在应激条件下合成最为迅速。正常情况下，HSP70 mRNA在细胞内有稳定表达，但很快被降解，所以正常脑组织中HSP70 mRNA及蛋白质含量极少。在脑出血等应急状态下，当其他蛋白合成受抑制时，HSP70表达反而增加[10]。

本研究发现，在脑出血早期HSP70 及caspase-3均有较高表达，1 d达高峰，此后逐渐降低。阳性细胞的细胞核及胞质中均可见到棕黄色、棕色或棕褐色颗粒。应用IL-10进行干预后，HSP70表达更明显，且有量效关系，而caspase-3表达则相反。这表明IL-10与HSP70及caspase-3的表达存在密切关系。高表达的HSP70除起到分子伴侣及对抗内源性损伤因子毒性而起到脑保护作用外，抑制神经细胞凋亡也是其重要的脑保护机制[11]。HSP70可通过抑制蛋白激酶c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)和P38的活性，抑制capase-3表达，干扰细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1)结合，阻断凋亡小体的形成，从而抑制细胞凋亡[12]。说明HSP70抗凋亡作用可能是通过抑制caspase-3活性实现的。

近年来研究表明，caspase家族在凋亡过程中起重要作用。已有许多证据表明脑细胞缺血死亡与caspase-3活化有关。在细胞凋亡过程中caspases-3处于核心位置，认为caspase-3是caspase级联瀑布下游最关键的凋亡蛋白酶，caspase-3的激活可以认为是细胞凋亡的标志[13]。本研究发现，应用IL-10干预后各组caspase-3水平自12 h起开始降低，且随IL-10剂量增大下降更显著。这提示脑出血后IL-10升高可能使caspase-3表达受到抑制，减少神经细胞凋亡，从而起到促进神经功能恢复，保护神经细胞的作用。IL-10对caspase-3抑制作用可能表现为两方面：(1)IL-10可通过上调HSP70表达来抑制caspase-3表达，从而减少细胞凋亡，起到神经保护作用；(2)IL-10可以直接抑制caspase-3诱导的细胞凋亡，认为IL-10是一种有效的caspase-3抑制剂，可以抑制caspase-3活性[14]，并通过阻止caspase-3参与由兴奋性氨基酸诱导的细胞凋亡[15]。

神经功能恢复是脑出血治疗的最终目标，也是评价药物疗效的重要指标。本研究大鼠行为学评分结果表明，应用IL-10干预后1、3、7 d L组及H组大鼠运动功能较M组明显改善，而IL-10高剂量组改善更明显，其分值随治疗时间的延长而逐渐下降，此变化趋势与HSP70表达增加及caspase-3表达下降的变化结果相吻合。表明应用IL-10可通过上调HSP70表达及抑制caspase-3表达，减少脑出血后神经细胞凋亡，从而显著降低脑出血后神经功能评分，促进脑出血后神经功能恢复。这可能是IL-10对出血性脑损伤的保护作用机制之一。

[1]Zhang XQ,Zhang ZM,Yin XL,et al.Exploring the optimal operation time for patients with hypertensive intracerebral hemorrhage：tracking the expression and progress of cell apoptosis of prehematomal brain tissues[J].Chin Med J,2010,123(10)：1246-1250.

[2]Avramovich-Tirosh Y,Amit T,Bar-Am O,et al.Therapeutic targets and potential of the novel brain-permeable multifunctiona1 Iron chelator-monoamine oxidase inhbitor drug,M-30,for the treatment of Ahheimer′s disease[J].Neurochem,2007,100(2)：490-502.

[3]Paxinos G,Watson C.大鼠脑立体定位图谱[M].诸葛启训，译.北京：人民卫生出版社，2005:6.

[4]孙皓，郭富强，王多姿，等.脑出血大鼠脑组织白介素-10和半胱氨酸蛋白酶-3表达的改变[J].临床神经病学杂志，2010，23(1)：31-33.

[5]Xu AJ,Zhu W,Tian F,et al.Recombinant adenoviral expression of IL-10 protects beta cell from impairment induced by pro-inflammatory cytokine[J].Mol Cell Biochem,2010,344(1-2)：163-171.

[6]Morita Y,Takizawa S,Kamiguchi H,et al.Administration of hematopoietic cytokines increases the expression of anti-inflammatory cytokine(IL-10) mRNA in the subacute phase after stroke[J].Neurosci Res,2007,58(4)：356-360.

[7]Shi W,Wang Z,Pu J,et al.Changes of blood-brain barrier permeability following intracerebral hemorrhage and the therapeutic effect of minocycline in rats[J].Acta Neurochir Suppl,2011,110(Pt 2)：61-67.

[9]Manaenko A,Fathali N,Chen H,et al.Heat shock protein 70 upregulation by geldanamycin reduces brain injury in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J].Neurochem Int,2010,57(7)：844-850.

[10]Fang HY,Ko WJ,Lin CY.Inducible heat shock protein 70,interleukin-18,and tumor necrosis factor alpha correlate with outcomes in spontaneous intracerebral hemorrhage[J].J Clin Neurosci,2007,14(5)：435-441.

[11]邱烈，管勤，袁英.HSP70对组织细胞的保护[J].重庆医学，2009，38(15)：1977-1980.

[12]Yousuf S,Atif F,Ahmad M,et al.Selenium plays a modulatory role against cerebral ischemia-induced neuronal damage in rat hippocampus[J].Brain Res,2007,1147(25)：218-225.

[13]Jie X,Wei CZ,Xu CQ,et al.Rifampicin protects PC12 cells against MPP+-induced apoptosis and inhibits the expression of an synuclein multimer[J].Brain Res,2007,30(1139)：220-225.

[14]Li JQ,Qi HZ,He ZJ,et al.Cytoprotective effects of human interleukin-10 gene transfer against necrosis and apoptosis induced by hepatic cold ischemia/reperfusion injury[J].J Surg Res,2009,157(1)：e71-e78.

[15]Xi GH,Richard FK,Julian TH.Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage[J].Lancet Neurol,2006,5(1)：53-63.