方 莉，陈绍兰，蔡 燕，蒋 红，黄光成，杨明辉，唐 中△

(1.川北医学院附属医院检验科，四川南充 637000；2.川北医学院医学检验系，四川南充 637000；3.川北医学院风湿免疫研究所，四川南充 637000)

白血病(leukemia)是临床上常见的血液系统恶性肿瘤，是严重危害人类健康的恶性疾病之一，近年发病率呈上升趋势，在儿童中尤为明显。有关白血病的治疗和发病机制研究一直很受关注。随着骨髓移植、靶向性治疗等手段应用，已使白血病的缓解率大大提高，部分病例甚至可治愈。但目前白血病的治疗仍以化疗为主，而化疗药物的非特异细胞毒性，在杀伤白血病细胞的同时，不加选择地对正常造血细胞和组织细胞造成损害，引起严重的不良反应。近年来，国内外学者对葡萄原花青素(grape procyanidins,GPC)进行了大量实验，研究表明GPC在预防和治疗人类疾病方面有独特的作用[1-2]。本研究以GPC对人白血病细胞(HL-60细胞)的凋亡作用进行研究，以期为GPC治疗白血病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要试剂 RPMI 1640 培养基购于Gibco公司；小牛血清购于杭州四季青公司；荧光素标记的连接素Ⅴ(AnnexinⅤ-fluoresein isothiocyanate,Annexin V-FITC) 和碘化吡啶(propidium iodide,PI) 双染凋亡检测试剂盒购于嘉美生物有限责任公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购于成都科龙化工试剂厂；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑嗅盐(MTT)为ATD公司产品；提取GPC的酿酒葡萄皮渣来源于河北省昌黎县凤凰酒庄，采用60%乙醇溶剂浸提法提取，紫外分光光度计测定，pH值示差法计算提取率，用DA-201型大孔吸附树脂纯化；其余试剂均为国产分析纯；HL-60细胞系本院风湿免疫研究所传代保存。

1.2主要仪器 二氧化碳培养箱(Heal Force HF90)、生物安全柜(Heal Force HFSAFE-120)、电子分析天平(AW320)、酶标仪(Benchmark BIO-RAD)、流式细胞仪(BECKMAN XL-MCL)、冷冻离心机(ILettich UNIVERSAC 16R)、低速离心机、荧光倒置显微镜(OLYMPUS CK40)、水平摇床、加样枪、96孔板、12 孔板、一次性滤器。

1.3试剂配制

1.3.1GPC的配制 准确称取GPC 500 mg于烧杯中，加入10 mL二甲基亚砜(DMSO)稀释，配制成浓度为50 mg/mL的GPC母液，0.22 μm滤膜过滤后，分装入干净玻璃瓶中，4 ℃避光保存。

1.3.2MTT 准确称取MTT 250 mg于烧杯中，加入0.01 mol/L，pH 7.4的PBS 50 mL稀释，配制成浓度为5 mg/mL的MTT溶液，0.22 μm滤膜过滤后，分装入干净玻璃瓶中，4 ℃避光保存。

表1 GPC对HL-60细胞增殖抑制率的影响

-：表示此项无数据。

1.4细胞培养

1.4.1复苏细胞 调节水浴箱温度为41 ℃，并提前在试管内放置10倍培养液，使培养液温度与室温一致。1 min内融化细胞，移取至试管内，1 000 r/min，离心5 min，弃上清液。

1.4.2细胞培养 加入含10 %小牛血清的RPMI-1640培养基，转入培养瓶中，并加入双抗(100 IU/mL青霉素，100 IU/mL链霉素)。37 ℃、体积分数为5 %的CO2培养箱中培养，每隔24 h观察细胞，如有抱团现象则换液，2～3 d，传代1次。

1.5MTT法检测细胞增殖抑制率 收集对数生长期HL-60细胞，加入含10 %小牛血清的RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为1×105/mL左右。种3个96孔板，每板设1个实验对照组和5个药物浓度实验组，以及1个空白对照组和5个药物浓度空白对照组，每组设6个复孔；其中实验对照组和5个药物浓度实验组每孔加入100 μL细胞浓度为1×105/mL的培养液，空白对照组和5个药物浓度空白对照组每孔加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培养基100 μL。置37℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，倒置显微镜下观察细胞。实验对照组和空白对照组每孔加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培养基100 μL；5个药物浓度实验组和5个药物浓度空白对照组分别加入GPC药物浓度为200、400、600、800、1 000 μg/mL的培养基100 μL，使孔内药物浓度分别为100、200、300、400、500 μg/mL。置37℃，5%CO2培养箱孵育24 h，倒置显微镜下观察。

每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养4 h。1 000 r/min，离心5 min，小心吸掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处(630 nm校准)测量各孔的吸光值(OD)。增殖抑制率=1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡及周期 收集对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度至1×105/mL，接种于两个12孔板，每孔500 μL，置37 ℃，5%CO2培养箱孵育24 h。实验对照组加入含10 %小牛血清的RPMI-1640 培养基500 μL，5个药物实验组分别加入GPC药物浓度为200、400、600、800、1 000 μg/mL的培养基500 μL，每组设4个复孔，使孔内药物浓度分别为100、200、300、400、500 μg/mL，置37 ℃，5%CO2培养箱孵育。将各孔内细胞转入流式管中，1 000 r/min，离心5 min，弃培养基。用4 ℃预冷的PBS重悬细胞1次，1 000 r/min，离心5 min，弃上清。用去离子水将10×Binding Buffer稀释成1×Binding Buffer，每管加入300 μL 1×Binding Buffer悬浮细胞。Annexin V-FITC标记： 加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，避光，室温孵育15 min。PI标记：加入5 μL PI后轻轻混匀，避光，室温孵育5 min。补加300 μL 1×Binding Buffer。用流式细胞仪检测正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

1.7统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MTT法检测HL-60细胞增殖抑制率结果 不同药物浓度的实验组处理24、48、72 h后细胞增殖抑制率见表1；随着GPC药物浓度的增加，其对HL-60细胞的增殖抑制率逐渐增高，呈时间-剂量依赖效应关系，见图1。

图1 GPC对HL-60细胞增殖率的影响

2.2HL-60细胞凋亡的检测 HL-60细胞经不同浓度的GPC处理24 h，用流式细胞仪检测GPC诱导的HL-60细胞凋亡；结果显示，GPC在低浓度(200 μg/ mL)时可引起少量的细胞发生凋亡。随着浓度的增加，GPC的细胞凋亡率也在不断增加，呈明显的量效关系。见图2。

图2 GPC对HL-60细胞凋亡的影响

3 讨 论

目前白血病的治疗仍以化疗为主，引起严重的不良反应，因此寻找新的不良反应小的抗白血病药物非常重要。从天然植物中寻找毒性低、疗效高，与其他化疗药物配伍使用的抗癌活性成分是抗肿瘤药物的重要来源之一。这些抗癌活性成分可提高抗肿瘤药物的抗肿瘤活性或降低其毒性，且其本身也具有一定的抗肿瘤活性，具有广阔的应用前景。

GPC由不同数目的黄烷-3-醇或黄烷-3,4-二醇聚合而成。GPC广泛存在于葡萄、山楂、松树、银杏、花生、番荔枝、野草莓、可可豆等植物中，尤其以葡萄皮、籽中含量最多。近年来，国内外许多学者的研究表明，GPC在预防和治疗人类疾病方面有独特的作用。Eng等[3]从红葡萄酒中提取出GPC的B二聚体，发现这种成分可以使实验鼠的乳腺癌瘤变小。用红葡萄酒中提取的GPC的B二聚体对乳腺癌不如人工合成药物的效果明显。Shih等[4]研究发现，GPC不仅可以抑制胃腺癌细胞的增殖，而且可以诱导其凋亡。Chen等[5]发现桑葚中的花青素矢车菊-3-葡萄糖甙和矢车菊-3-芸香甙对人类肺癌细胞A549的转移和入侵具有阻止作用。Feng等[6]发现黑树梅中的花青素矢车菊-3-芸香甙对血癌细胞HL-60有杀灭作用而对正常细胞无影响。杀灭作用机制为矢车菊-3-芸香甙刺激JNK激酶，由JNK激酶蛋白调节癌细胞的凋亡程序而杀死癌细胞。国内学者研究发现，GPC具有抗氧化、抗自由基损伤、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗衰老、保护心血管系统等多种生理、药理功效[7]。多项实验研究表明，GPC体外对前列腺癌细胞[8-9]，人肝癌细胞[10-11]， 肺癌细胞[12]等都有明显的增殖抑制和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，张海晖等[13]同时研究了莲房GPC对肺癌LETP-2细胞、胃腺癌SGC-7901细胞、黑色素瘤A375细胞的作用，得出莲房GPC体外对此3种细胞均有显著性抑制作用。池余刚等[14]还通过PCR检测发现GPC可以明显降低survivin的mRNA和蛋白水平的表达，可能通过降低survivin的表达，在体外抑制SKOV3细胞增殖，并促进其凋亡。高爱霞等[15]的体内研究表明GPC能明显抑制肺癌细胞NCI-H460细胞的增殖、诱导细胞凋亡和抑制裸鼠肿瘤的生长。虽然现在国内外在GPC对白血病细胞，特别是HL-60细胞的作用研究还很少，但从上述研究中可以看出，GPC在对肿瘤细胞的增殖抑制和促凋亡作用是非常明显的，这也为作者提供了大量的参考资料和实验依据。

本研究采用MTT法检测细胞增殖抑制率，通过实验结果可以看出，不同浓度GPC对HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用，随着GPC浓度的增加和作用时间的延长，其对HL-60细胞增殖抑制率逐渐升高，GPC可显著抑制HL-60细胞体外生长，并呈时间-剂量效应；同时Annexin V-FITC和PI双染，采用流式细胞术检测以不同浓度GPC作用24 h后HL-60细胞的凋亡，发现GPC具有诱导HL-60细胞凋亡的能力，并且随着GPC药物浓度的增加， HL-60细胞发生凋亡的比例也随之增加。

综上所述，葡萄皮渣中提取的GPC在体外可明显抑制增殖HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡，且抑制细胞增殖作用呈时间-剂量依赖效应。GPC为白血病治疗的新药物选择提供了新的参考，但尚需进一步研究其抗肿瘤的机制及其在体内的详细药理过程。

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