陈祥娥，凌沛学

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院 博士后科研工作站，山东 济南250101)

肝素微生物生产展望

陈祥娥1，2，凌沛学1，2

(1.山东大学 药学院，山东 济南 250012;2.山东省生物药物研究院 博士后科研工作站，山东 济南250101)

肝素作为重要的抗凝血药物在临床中广泛应用。近年来，动物来源肝素的质量问题成为人们关注的焦点，研究开发非动物源性肝素的大规模生产方式成为一大热点。采用与肝素生物合成前体具有相似结构的细菌荚膜多糖heparosan作为底物，已成功合成肝素、硫酸乙酰肝素，并获得多种具有肝素相关功能的肝素衍生物，是一种较有希望的非动物源性肝素生产方式。本文对此进行综述。

heparosan;肝素;微生物发酵

肝素(HP)被发现已90余年，作为抗凝血和抗血栓药物广为应用。HP还具有降血脂、抗炎、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用［1-2］，是重要的糖胺聚糖(GAG)类生化药物之一。目前，商品化HP主要是从肠黏膜等组织中提取。2008年在HP使用中，曾因杂质过量出现严重的过敏反应甚至死亡［3-4］。动物源性HP的质量成为广泛关注的焦点，同时也引发了对非动物来源HP的需求。

微生物多糖的生产以其潜在的生物工程应用，得到广泛关注。已知有多种细菌可以产生含GAG样聚合物的荚膜多糖［5］。目前，透明质酸(HA)已实现细菌发酵生产，而HP等其他重要GAG的大规模微生物发酵仍处在探索阶段。

动物体内HP的二糖单位主要为葡糖胺(GlcN)和艾杜糖醛酸(IdoUA)，GlcN的氨基氮和C6位均带有硫酸基。HP合成时二糖中是葡糖醛酸(GlcUA)，然后差向异构化为IdoUA，并随之进行C2位硫酸化。脊椎动物合成HP的过程是先催化合成多糖heparosan作为前体，然后进行一系列的硫酸化及异构化修饰［6］。细菌heparosan的发现，引起了广泛关注。因为它使通过细菌合成，化学或生物修饰生产HP、硫酸乙酰肝素(HS)成为可能。本文就以heparosan为前体的HP类微生物发酵生产作一综述。

1 heparosan

肝素前体heparosan又称 N-acetylheparosan，(-GlcUA-1，4-GlcNAc-1，4-)n(其中GlcUA代表葡糖醛酸;GlcNAc代表乙酰葡糖胺)，是某些细菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，同时也作为HP和HS的生物合成前体，在水螅和脊椎动物中都有发现［7］。其二糖骨架结构虽与脊椎动物中的HP类似，但未硫酸化，也没有将GlcUA异构化为IdoUA。

图1 heparosan二糖单位的结构(A)和HP的主要和可变重复二糖单位(B)

采用生物工程的方法，以heparosan为前体合成HP提供了一种新的、更为安全且较有希望的非动物源性生产方式［8］。目前发现的荚膜多糖中含heparosan的细菌有大肠杆菌K5(E.coli K5)和多杀性巴氏杆菌D型(P.multocida type D)。其中P.multocida产生的heparosan平均相对分子质量(Mr)较高，为 2.0 ×105～3.0 ×105，而 E.coli K5 heparosan(K5PS)大小与 HP接近，Mr为1.0 ×104～2.0×104。所以，以K5PS为HP、HS生物合成前体的研究开展较多，应用也较为广泛。研究表明，从E.coli K5获得的重均分子质量(Mw)1.0×104以上的heparosan可在酶的作用下转化成类似于HP的具有抗凝血活性的多糖［9-10］。

2 合成方法

脊椎动物HS的生物合成过程是先催化合成GlcUAGlcNAc二糖重复单位组成的heparosan多糖骨架。经N-去乙酰化酶/硫酸转移酶(NDST)作用，将GlcNAc转化成N-磺基葡糖胺(GlcNS)。N-硫酸化后，C5-异构化酶(C5-epi)再将部分GlcUA转化成IdoUA。所得多糖经2-O-硫酸转移酶(2-OST)，6-O-硫酸转移酶(6-OST)和3-O-硫酸转移酶(3-OST)的修饰分别将磺基加入IdoUA和GlcUA的C2位以及GlcN的C6位和C3位。虽然，酶修饰不一定遵循上述顺序，但NDST对GlcNAc的作用决定异构化和O-硫酸化的水平［11］。

以heparosan为前体，酶为基础的HP、HS合成是一种较有希望的非动物源性生产方式。与化学合成法相比，化学-酶法合成具有HP、HS生物合成酶的高度区域选择性，在合成硫酸化多糖和较大低聚糖中具有显著优势。HS生物合成途径的拟态化学-酶法或全酶法合成可产生具有特殊生物活性的多种 HS 结构［12］。

研究认为，HP类产品的抗凝血活性主要依赖于其多糖链中能与抗凝血酶(AT)结合的五糖序列。Lindahl等［9］以K5PS为底物，化学法N-去乙酰化和N-硫酸化后，经C5-epi作用，将部分GlcUA转化为IdoUA，所得异构化N-硫酸化K5PS与N，N-二甲基甲酰胺和吡啶三氧化硫反应，实现全部O-硫酸化，二甲亚砜-甲醇(9∶1)选择性去硫酸化后，再进行GlcN 6-O-硫酸化及N-硫酸化，最终获得可与AT结合的特殊“neoheparin”。Kuberan等［13］则采用全酶法合成了ATⅢ结合五糖。通过选择适当的生物合成用酶相组合，也可得到具有HP类似结构及抗凝血活性的硫酸化多糖［14］。

HP、HS生物合成过程中所涉及的特异酶已基本克隆得到，已在E.coli中成功表达16种参与其生物合成的酶(部分见表1)。可实现以 heparosan为前体，经 NDST、C5-epi、2-OST、3-OST、6-OST 等酶修饰，合成 HP 和 HS［15］。

表1 E.coli中表达的部分HS生物合成用酶

以heparosan为前体合成HP及其类似物首要解决的就是heparosan的产量问题。Wang等［16］采用优化培养基，富氧给予并指数补加葡萄糖，在7 L发酵罐中培养E.coli K5菌株制备 heparosan，产量可达15 g/L，Mr为5.8 ×104，Mw为8.4×104。此外，还可联合应用发酵工程、基因工程和代谢工程等，以获得具有理想结构特性及较高产量的heparosan，作为生物工程HP生产前体［17］。

3 应用

以heparosan为前体可合成HP、HS及多种衍生物，heparosan及其衍生物具有与HP类似的结构，其硫酸化衍生物亦有许多与HP类似的生物活性，主要有抗凝血、调节细胞因子及抗病毒作用等。以K5PS为前体合成的HP类衍生物见图2。

图2 K5荚膜多糖及其衍生物的化学结构

研究发现，未经修饰的heparosan可抑制人乳头状瘤病毒16(HPV-16)假病毒颗粒与固定化HP间的相互作用，高度O-硫酸化、N，O-硫酸化的多糖衍生物则具有抗成纤维细胞生长因子2(FGF-2)活性，抑制人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)和HPV的感染作用等。磺胺heparosan则具有与HP类似的抗凝血和抗蛋白酶活性，能释放组织因子通道抑制剂，抑制组织因子介导的血小板激活作用［18］。

Munoz等［19］将生物素酰化的K5PS固定在传感器芯片上，用参与HP生物合成的酶选择性修饰获得与HP结构类似的多糖，通过检测这些多糖与ATⅢ的表面等离子体共振确定其相互作用，实现HP-蛋白质相互作用的快速筛选，并可提供参与结合的关键硫酸化基团的结构信息。

4 展望

近年来，HP的非动物源性生产研究较多，有化学法［20］、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞代谢工程［21-22］等多种方法，其中以heparosan为前体，酶修饰为基础的HP合成方式是一种较有希望的替代方法，可产生具有特殊生物活性的多种HP产品。相信随着研究的不断深入，可实现HP的大规模产业化微生物生产。

［1］Kreuger J，Spillmann D，Li J P，et al.Interactions between heparan sulfate and proteins:the concept of specificity［J］.J Cell Biol，2006，174(3):323-327.

［2］Gu L，Wang H，Guo Y L，et al.Heparin blocks the adhesive of E.coli O157:H7 to human colonic epithelial cells［J］.Food Control，2008，19(12):1119-1125.

［3］Liu H，Zhang Z，Linhardt R J.Lessons learned from the contamination of heparin［J］.Nat Prod Rep，2009，26:313-321.

［4］Guerrini M，Beccati D，Shriver Z，et al.Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events［J］.Nat Biotechnol，2008，26(6):669-675.

［5］DeAngelis P L.Microbial glycosaminoglycan glycosyltransferases［J］.Glycobiology，2002，12(1):9R-16R.

［6］Busse M，Feta A，Presto J，et al.Contribution of EXT1，EXT2，and EXT3 to heparan sulfate chain elongation［J］.JBiol Chem，2007，282(45):32802-32810.

［7］陈祥娥，凌沛学，张天民.细菌肝素前体heparosan合酶［J］.中国生化药物杂志，2008，29(6):422-424.

［8］Laremore TN，Zhang F，Dordick JS，et al.Recent progress and applications in glycosaminoglycan and heparin research［J］.Curr Opin Chem Biol，2009，13(5-6):633-640.

［9］Lindahl U，Li JP，Kusche-Gullberg M，et al.Generation of“Neoheparin”from E.coli K5 capsular polysaccharide［J］.J Med Chem，2005，48(2):349-352.

［10］ Zhang Z Q，McCallum SA，Xie J，et al.Solution structures of chemoenzymatically synthesized heparin and its precursors［J］.J Am Chem Soc，2008，130(39):12998-13007.

［11］ Kusche M，Hannesson H H，Lindahl U.Biosynthesis of heparin.Use of Escherichia coli K5 capsular polysaccharide as a model substrate in enzymic polymer-modification reactions［J］.Biochem J，1991，275(Pt 1):151-158.

［12］ Chen J，Avci F Y，Munoz E M，et al.Enzymatic redesigning of biologically active heparan sulfate［J］.JBiol Chem，2005，280(52):42817-42825.

［13］ Kuberan B，Lech M Z，Beeler D L，et al.Enzymatic synthesis of antithrombin III binding heparan sulfate pentasaccharide［J］.Nat Biotechnol，2003，21(11):1343-1346.

［14］ Chen J，Jones C L，Liu J.Using an enzymatic combinatorial approach to identify anticoagulant heparan sulfate structures［J］.Chem Biol，2007，14(9):986-993.

［15］ Peterson S，Frick A，Liu J.Design of biologically active heparan sulfate and heparin using an enzyme-based approach［J］.Nat Prod Rep，2009，26(5):610-627.

［16］ Wang Z Y，Ly M，Zhang F，et al.E.coli K5 fermentation and the preparation of heparosan，a bioengineered heparin precursor［J］.Biotechnol Bioeng，2010，107(6):964-973.

［17］ Wang Z，Dordick J S，Linhardt R J.Escherichia coli K5 heparosan fermentation and improvement by genetic engineering［J］.Bioeng Bugs，2011，2(1):63-67.

［18］陈祥娥，凌沛学.大肠杆菌K5荚膜多糖硫酸化衍生物的应用［J］.中国生化药物杂志，2009，30(6):427-429.

［19］ Munoz E，Xu D，Avci F，et al.Enzymatic synthesis of heparin related polysaccharides on sensor chips:rapid screening of heparin-protein interactions［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，339(2):597-602.

［20］ Petitou M，van Boeckel C A.A synthetic antithrombin Ⅲ binding pentasaccharide is now a drug!What comes next? ［J］.Angew Chem Int Ed Engl，2004，43(24):3118-3133.

［21］ Bame K J，Lidholt K，Lindahl U，et al.Biosynthesis of heparan sulfate.coordination of polymermodification reactions in a Chinese hamster ovary cell mutant defective in N-sulfotransferase［J］.JBiol Chem，1991，266(16):10287-10293.

［22］ Zhang L，Lawrence R，Frazier B A，et al.CHO glycosylation mutants:proteoglycans［J］.Methods Enzymol，2006，416:205-221.

Progress on microbial production of heparin

CHEN Xiang-e1，2，LING Pei-xue1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Postdoctoral Scientific Research Workstation，Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

TQ929

A

1005-1678(2012)04-0502-03

2011-07-19

陈祥娥，女，博士研究生，微生物与生化药学专业;凌沛学，通信作者，研究员，博士生导师，Tel:0531-81213003，E-mail:peixue.ling@bausch.com。