张晓丽 赵舒武 王富武 邴鲁军 郝 晶＊

（1山东大学医学院组胚教研室，济南250012；2天津中医药大学组胚教研室，天津300193）

人完全性葡萄胎中c-myc的表达及意义

张晓丽1赵舒武2王富武1邴鲁军1郝 晶1＊

（1山东大学医学院组胚教研室，济南250012；2天津中医药大学组胚教研室，天津300193）

目的 研究c-myc基因在人完全性葡萄胎中的表达及其意义。方法 取人完全性葡萄胎30例，正常早孕流产标本10例，用SABC免疫组织化学染色方法，检测c-myc基因在两种组织中的表达情况，并采用图像分析技术，对正常早孕绒毛组和完全性葡萄胎组c-myc的表达情况进行对比分析。结果 与正常绒毛相比，c-myc基因在完全性葡萄胎组织中的表达量和表达的空间特异性有明显不同。结论 c-myc基因可能与完全性葡萄胎的发生密切相关。

c-myc基因；完全性葡萄胎；正常胎盘绒毛；免疫组化

完全性葡萄胎是在胚胎发生过程中，由于胎盘绒毛滋养细胞过度增生而形成的一种病理变化，以滋养层细胞异常增生、绒毛间质水肿及间质血管缺乏为主要特征。在某些方面，其生物学行为与肿瘤非常相似。在我国，发生率明显高于欧美，因此研究某些癌基因在发生过程中的表达对阐明完全性葡萄胎的发生机制有非常重要的意义。本研究采用敏感性高、特异性强且操作快速简便的免疫组织化学SABC方法，检测了早期流产的正常胎盘绒毛和完全性葡萄胎组织中c-myc基因的表达情况，以探讨c-myc基因的表达状况与完全性葡萄胎发生的相关性。

材料和方法

1.材料

1.1 标本来源 30例完全性葡萄胎均为临床首次清宫组织，孕龄为6-16周不等；同时收集6-12周早孕人工流产绒毛标本10例作为对照。标本来源：山东医科大学附属医院、山东省立医院和一些县、市级医院的妇产科病人，病理诊断为完全性葡萄胎。正常胎盘绒毛标本取自山东医科大学附属医院计划生育门诊刮宫流产病例。

1.2 试剂 鼠抗人c-myc单克隆抗体及SABC免疫组化检测试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。

2.方法

2.1 免疫组织化学染色 所有标本经10%福尔马林固定，石蜡切片7μm厚 ，经二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，3%H2O2封闭过氧化物酶，恒温箱96℃-100℃20min进行抗原修复。滴加0.01mol／L pH7.4的PBS稀释的c-myc一抗（1：100）4℃孵育过夜，阴性对照组以0.0lmol／L pH 7.4的PBS代替一抗。滴加0.01mol／L pH 7.4的PBS稀释的二抗37℃孵育30min，最后室温下DAB显色，镜下控制显色时间，至阴性对照将着色时为止。期间各步均以0.0lmol／L pH 7.4的PBS洗涤3次，每次5min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

2.2 显色结果判定 c-myc基因免疫组化阳性结果表现为滋养细胞胞质呈棕黄色，阴性对照不显色。用彩色图像分析系统对标本中阳性细胞进行定量分析：每张切片选10个高倍视野，每例共测10个细胞的阳性信号灰度值。将图像分析所得数据¯x±s表示。

2.3 统计学处理 用spss统计软件进行方差分析。

结 果

正常早孕胎盘绒毛及完全性葡萄胎均有c-myc基因的阳性表达，定位于细胞质，呈棕黄色颗粒状。划分标准为：未着色为阴性（-），浅黄色着色为弱阳性（＋），黄色着色为中度阳性（＋＋），棕色着色为强阳性（＋＋＋ ）。

1.早孕绒毛组织免疫组化染色结果 正常绒毛染色深浅不一，浅染绒毛合体滋养层为弱阳性着色，细胞滋养层细胞为阳性着色；深染绒毛中细胞滋养层和合体滋养层细胞均为强阳性着色（图1，2，3）。

2.完全性葡萄胎组织免疫组化染色结果 cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎组织中所有绒毛染色类型相同，无深染绒毛和浅染绒毛之分，但在细胞着色类型上有差异：细胞滋养层和间质呈阴性着色，合体滋养层细胞呈强阳性着色（图4，5，6）。

3.图像分析和统计结果 染色标本经图像分析系统处理，方差分析统计结果表明，完全性葡萄胎组织细胞滋养层c-myc基因表达强度和正常绒毛细胞滋养层细胞之间有差异（表1）；同时完全性葡萄胎合体滋养层细胞c-myc基因表达强度和正常绒毛中浅染绒毛中的合体滋养层细胞的表达也有明显不同。

讨 论

完全性葡萄胎是滋养细胞肿瘤中最常见的一型，对其病因学和发病学的研究，迄今为止仍停留在假说阶段。刘丽君等研究了PCNA和Caspase3在妊娠滋养细胞疾病中的表达及意义表明PCNA和Caspase3表达异常和增殖／凋亡失衡是引起妊娠滋养细胞疾病的重要因素［1］。

已有报道，c-myc mRNA水平在不同细胞周期时相有很大差别，其转录速率仅在由G0期进入G1期时有较大程度的增高，而在其他细胞周期时相和细胞分化时均保持在大致相同的较低水平上［2～5］。

Pfeifer-Ohlsson［6］等发现，在人正常胎盘组织中，c-myc mRNA呈阶段特异性表达，其在不同阶段的表达水平可相差30倍；c-myc mRNA主要表达于细胞滋养层细胞。这与我们的免疫组化结果相符。我们的免疫组化染色结果还显示，c-myc基因在正常早孕绒毛组织中的染色深浅不一，可能是由于不同部位的绒毛滋养层细胞处于不同的细胞周期时相和分裂、分化阶段；染色较深的细胞，提示其细胞滋养层细胞可能分裂较活跃，而染色较浅的细胞，其分裂活性较低，或可能处于细胞间期或分化阶段。

同时，我们还发现，完全性葡萄胎合体滋养层细胞中c-myc癌基因蛋白的表达强度远远高于细胞滋养层细胞，而在正常胎盘组织中，合体滋养层细胞细胞c-myc的表达低于细胞滋养层细胞。C-myc癌基因蛋白表达的这种细胞特异性是以往没有报道过的，我们认为这可能就是c-myc癌基因蛋白在合体滋养层细胞的过度表达导致了完全性葡萄胎滋养层细胞的异常增生。

C-myc基因在正常组织中是细胞生长和细胞周期演进的一个正调控基因，也是调节细胞分化的关键基因，其过度表达不仅可促进细胞的增殖和恶性分化，同时还可以抑制细胞的正常分化。在正常胚胎发育过程中，细胞滋养层细胞是一种具有旺盛分裂增殖能力的细胞，其c-myc癌基因应有较丰富的表达，我们的结果也证实了这一点，说明c-myc基因确与细胞的增殖状态有关。pfeifer-Ohlsson等［6］的结果也提示：c-myc转录与细胞滋养细胞增殖有关，可以作为胚胎细胞增殖的标志物。

本研究结果表明，完全性葡萄胎绒毛合体滋养层细胞中c-myc癌基因蛋白表达明显增强，与细胞滋养层和间质之间差异有统计学意义（P＜0.01）；同时与正常胎盘绒毛的c-myc蛋白表达之间差异也有统计学意义（P＜0.01）。C-myc癌基因蛋白在完全性葡萄胎组织中表达量明显高于正常绒毛组织，提示c-myc与完全性葡萄胎的发生、发展有关。它还可能有利于其它促增殖癌基因的变异，并使转化的细胞生存下来，促进完全性葡萄胎的发生。

Fulop V等［7］发现正常胎盘、完全性葡萄胎和绒毛膜癌的合体滋养层染色均比部分性葡萄胎增强，得出结论，c-myc癌蛋白在完全性葡萄胎和绒毛膜癌的病理发生中起重要作用，而与部分性葡萄胎的发生可能无关。Yokoyama等［8］利用 Northern blot和原位杂交方法发现，c-myc基因在葡萄胎的合体滋养层细胞中有表达，这与我们的免疫组化染色结果相符。

Cheung A N 等［9］利用 Northern blot和免疫组化方法比较检测了胎盘和葡萄胎中c-myc表达，发现c-myc在胎盘和葡萄胎组织中表达量均很低，与我们的结果不相符，可能与其所取胎盘孕龄较大及葡萄胎分型有关。李玉红等［10］的结果表明c-myc基因表达的妊娠滋养细胞肿瘤可能具有更强的分裂增殖活动及浸润能力；郭晓梅等［11］的实验结果也证明c-myc基因可能参与滋养细胞由良性演变为恶性的过程；余志英等［12］的实验结果也支持c-myc基因与妊娠滋养细胞疾病的发展及妊娠滋养细胞肿瘤临床分期有关；刘金玲等［13］的实验结果也说明c-myc基因蛋白的过度表达与水泡状胎块恶变有关。

我们的实验结果表明，与正常早孕绒毛相比，cmyc基因蛋白在完全性葡萄胎组织中的表达部位和表达量均有明显不同，结合以上分析得出结论，cmyc基因的表达与人完全性葡萄胎的发生密切相关，其激活可能是完全性葡萄胎发生的重要原因之一，还可能参与完全性葡萄胎的恶变。

图1 正常绒毛c-myc免疫组化染色结果，示绒毛染色深浅不一，浅染绒毛中细胞滋养层细胞着色稍深，间质阴性表达，×100图2 正常绒毛c-myc表达示深染绒毛，c-myc在细胞滋养层中的表达强度高于合体滋养层，×400图3 正常绒毛c-myc表达示浅染绒毛中细胞滋养层c-myc表达强度高于合体滋养层，×400图4 完全性葡萄胎绒毛组织c-myc免疫组化染色结果，示所有绒毛深染，×100图5 完全性葡萄胎绒毛组织c-myc免疫组化染色结果，示细胞滋养层和间质呈阴性表达；合体滋养层细胞呈强阳性表达，×400图6 完全性葡萄胎绒毛组织c-myc免疫组化染色结果，示细胞滋养层和间质呈阴性表达；合体滋养层细胞呈强阳性表达，苏木素复染，×400

表1 完全性葡萄胎和正常绒毛c-myc蛋白免疫组化染色图像分析和统计结果Table 1 Image Analysis of C-myc Expression by immunohistochemical staining method and Statistical Result in Complete Hydatidiform Mole and Normal Villi

［1］刘丽君，管英俊，赵司顺，等.PCNA和Caspase-3在妊娠滋养细胞疾病中的表达及意义.中国优生与遗传杂志，2010，18（6）：61-62

［2］Rabbitts PH，Watson JV，Lamond A，et al.Metabolism of c-myc gene products：c-myc mRNA and protein expression in the cell cycle.EMBO Journal，1985，4：2009-2015

［3］Thompson DM，Gill GN.The EGF recepter：structure，regulation and potential role in malignancy.Cancer Surveys，1985，4：767-788

［4］Thompson CB，Challoner PB，Neiman PE，et al.Levels of c-myc oncogene mRNA are invariant throughout the cell cycle.Nature，1985，314：363-366

［5］Kaczmarek L.Protooncogene expression during the cell cycle.Laboratory Investigation，1986，54：365-376

［6］Pfeiffer-Ohlssons，Goustin AS，Rydnert J，et al.Spatial and temporal pattern of cellular myc oncogene expression in developing human placenta：implications for embryonic cell proliferation.Cell，1984，38（2）：585-596

［7］Fulop V，Mok SC，Genest DR，et al.c-myc，c-erbB-2，c-fms and bcl-2oncoproteins.Expression in normal placenta，partial and complete mole，and choriocarcinoma .J Reprod Med，1998 ，43（2）：101-110

［8］Yokoyama S，Nimi S，Tsuruoka M，et al.The expression of c-myc，c-fms，c-sis oncogenes in the trophoblast of normal pregnancy and trophoblastic disease.Nippon Sanka Fujinka Gakkai Zasshi，1988，40（12）：1867-1874

［9］Cheung AN，Srivastava G，et al.Expression of c-myc and c-fms oncogenes in trophoblastic cells in hydatidiform mole and normal human placenta.J Clin Pathol，1993，6（3）：204-207

［10］李玉红，赵向阳，梅立新，等.葡萄胎中c-myc和ras癌基因表达及其意义.解剖学研究，2002，24（3）：194-196

［11］郭笑梅，胡伦颖，高秉兰，等.妊娠滋养细胞疾病c-myc基因的表达及其临床意义.实用癌症杂志，1998，13（4）：270-272

［12］余志英，漆秀梅，刘英，等.癌基因c-myc和n-ras在妊娠滋养细胞疾病中表达的研究.同济医科大学学报，2001，30（4）：363-365.

［13］刘玉玲，崔金全，李筱梅，等.正常胎盘及葡萄胎滋养细胞H-ras和C-myc基因产物表达.中国实用妇科与产科杂志，1998，14（4）：225-227.

Experimental Study of the Expression of C-myc Gene in Human Complete Hydatidiform Moles

Zhang Xiaoli1，Zhao Shuwu2，Wang Fuwu1，Bing Lujun1，Hao Jing1＊
（1Department of Histology and Embryology，Medical School，Shandong University，Jinan250012；2Department of Histology and Embryology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicince，Tianjin300193，China）

Objective To study the expression and significance of the c-myc gene in human complete hydatidiform moles.Methods 30hydatidiform moles and 10normal early-pregnancy aborted samples were obtained to detect the c-myc gene expression by using SABC immunohistochemical staining，and image analysis was used to analyze the c-myc expression in complete hydatidiform moles and normal villi.Results Compared with those of the normal villi，the amount and the spatial characteristics of c-myc gene expression in hydatidiform moles are quite different.Conclusion The c-myc gene may has a close relationship with the genesis of human complete hydatidiform moles.

C-myc gene；Hydatidiform mole；Placental Villus；Immunohistochemistry

R737.33

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.011

2011-05-05

2011-09-20

张晓丽，女（1972年），汉族，讲师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）