尹燕志 牟授菡 鞠建伟＊ 吕丛奎 孙晓燕 邓磊修

高糖对原代培养人肾小球系膜细胞表达 MMP-9、TIMP-1的影响

尹燕志1牟授菡1鞠建伟1＊吕丛奎1孙晓燕1邓磊修2

（1山东烟台经济技术开发区医院，烟台264006；2山东先声麦得津生物制药有限公司，烟台264003）

目的 了解高糖对原代培养的人肾小球系膜细胞表达 MMP-9、TIMP-1和 MMP-9／TIMP-1的影响，进一步探讨糖尿病肾病的发病机制。方法 取自愿水囊引产的胎儿肾，解剖取肾皮质剪碎，应用肾皮质组织块法合优生选择法对人肾小球系膜细胞进行原代培养。ELISA方法检测 MMP-9、TIMP-1的表达变化。结果 与正常组相比较，高糖组 MMP-9在24h、48h、72h均显著降低（P＜0.01），TIMP-1在24h、72h可显著升高 （P＜0.05），48h表达降低；MMP-9／TIMP-1的比值在24h、48h、72h均显著降低（P＜0.01）。结论 高糖能够降低 MMP-9／TIMP-1，与肾小球系膜细胞细胞外基质降解能力降低密切相关。

人系膜细胞；原代培养；金属基质蛋白酶9；金属蛋白酶组织抑制剂1；高糖

细胞外基质（extracellular matrix，ECM）增多是糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）的主要病理标志［1］，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）、金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是参与ECM 降解的主要酶系统［2］。本研究通过体外人胚肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）原代培养并给予高糖环境刺激，模拟糖尿病（diabetes mel-litus，DM）体内病理环境，了解高糖对GMCs表达MMP-9，基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（tissue inhibitors of metalloproteinases-1，TIMP-1）的 影响，进一步探讨DN的病理生理机制。

材料和方法

1.材料

DMEM低糖培养基（美国ScienCell），胎牛血清（Gibco公司），MsCM（含2%FBS和 MsCGS）（美国ScienCell），胶原酶Ⅳ（Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）（Gibco公司），牛血清白蛋白（美国Amresco）小鼠抗人α-肌动蛋白、小鼠抗人抗肌球蛋白单克隆抗体、小鼠抗人抗波形蛋白、小鼠抗人抗结蛋白、细胞角蛋白（武汉博士德）、Ⅷ因子一抗（SantaCruz公司），羊抗鼠IgG-FITC荧光二抗（武汉博士德），人 MMP-9、TIMP-1ELISA 试剂盒（武汉博士德）。

1.2 肾组织来源

取我院自愿水囊引产的妊娠16-32周的胎儿肾（经胎儿家属同意捐赠，孕母无糖尿病、高血压、冠心病等其它病史及传染病病史）。

2.方法

2.1 GMCs体外培养 应用肾皮质组织块法合优生选择法［3］培养GMCs，解剖取肾皮质，剪碎，置200目不锈钢筛网上过滤，收集筛网上组织，加入含0.15%Ⅳ型胶原酶的DMEM低糖培养基，在37℃恒温电磁搅拌器上电磁搅拌热消化30min离心两次后，转入培养皿，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。从第三代起更换为MsCM培养基。以下实验均选用3-7代细胞。

2.2 选取3代的GMCs在相差显微镜下观察其形态。

2.3 免疫荧光化学鉴定 用4%多聚甲醛溶液固定细胞，滴加0.5%Triton X-100，10%小牛血清白蛋白封闭，滴加PBS稀释的一抗（α-肌动蛋白、抗肌球蛋白、波形蛋白、结蛋白、角蛋白、Ⅷ因子一抗稀释浓度分别为1∶50、1∶50、1∶100、1∶50、1∶25、1∶20），4℃冰箱过夜，滴加IgG-FITC荧光二抗（稀释度为1∶32，37℃避光反应60min，50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并摄影。

2.4 ELISA方法检测 MMP-9、TIMP-1取培养皿中对数生长期的系膜细胞，以5×105／ml接种于96孔板上。贴壁生长24h以后，更改为含0.5%FBS的MsCM培养24h，根据实验分组的不同加入相应的培养液：正常组（NG）：葡萄糖5mmol／L；高糖组（HG）：葡萄糖30mmol／L；每组设6个平行复孔分别培养24、48、72h后收集细胞上清，-20℃下保存待测，严格按照试剂盒说明书进行操作。

3.统计学处理

此时此刻，世间的万事万物都已经失去了往日的光华，往日生机勃勃的景象已不复存在，清寒的气息开始遍布大地，你开始翻捡出了厚厚的冬衣！

所有数据均以 表示，应用SPSS16.0统计软件进行配对样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.GMCs形态学观察

培养7-10d后，相差显微镜下可见大量细胞呈梭形，随着培养时间的延长，部分细胞呈不规则星形和细长形，单核，密集生长时可重叠，其中偶见鹅卵石样上皮细胞和扁平的多边形内皮细胞（图1）。

2.免疫荧光化学鉴定结果

免疫荧光化学结果显示，GMCs小鼠抗人α-肌动蛋白、抗肌球蛋白单克隆抗体、抗结蛋白、抗波形蛋白表达为阳性（图2-5），细胞角蛋白、Ⅷ因子一抗表达为阴性，符合肾小球系膜细胞特征。

3.高 糖 下 GMCs 表 达 MMP-9、TIMP-1 及MMP-9／TIMP-1的变化

与正常组相比，高糖组在24h、48h、72h表达MMP-9均显著降低（P＜0.01），见表1；TIMP-1在24h、72h显著升高 （P＜0.05），48h表达降低，见表2；MMP-9／TIMP-1的比值在24h、48h、72h均显著降低（P＜0.01），见表3。

表1 高糖对系膜细胞表达MMP-9的影响Table 1 Effects of high glucose on the expression of MMP-9in GMCs （pg／ml，¯x±s，n＝6）

表2 高糖对系膜细胞表达TIMP-1的影响Table 2 Effects of high glucose on the expression of TIMP-1in GMCs （pg／ml，x¯±s，n＝6）

表3 高糖对系膜细胞分泌MMP-9／TIMP-1的影响Table 3 The ratio of MMP-9／TIMP-1in GMCs at different time points（pg／ml，¯x±s，n＝6）

讨 论

MMP-9是人体内最重要的MMPs之一，因其作用底物广泛，表达细胞多，且能参与人体许多生理及病理过程而备受重视。TIMP-1是 MMP-9特异性抑制因子，在ECM积聚和降解的生理平衡中起关键作用。现已证实，肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、肾小管上皮细胞等均能不同程度地表达MMP-9。近年来的研究提示，高糖环境能够引起MMPs／TIMPs的异常表达。Singh等［4］把原代培养的大鼠肾系膜细胞在30mmol／L葡萄糖环境培养5d，其MMP-1、MMP-2活性及表达均显著降低，TIMP-2表达增加。Han等［5］发现，高糖可使大鼠肾近端小管细胞 MMP-2的表达和活性下降，TIMP-2的表达及活性上调。Qi等［6］研究发现，在高糖环境中培养的成纤维细胞MMP-9表达增加，TIMP-1 表 达 减 少。 姚 芳 等［7］体 外 培 养 大 鼠HBZY-1肾小球 系膜细胞 株，采用 RT-PCR 及Western印迹法检测发现高糖可以通过减少MT1-MMP表达引起肾小球ECM代谢失衡而发生积聚。本研究观察了高糖环境下GMC表达 MMP-9及TIMP-1的变化，与正常组相比较，发现高糖组MMP-9在 24h、48h、72h 均 显 著 降 低，高 糖 组TIMP-1在24h、72h可显著升高 ，48h表达无统计学意义，MMP-9／TIMP-1的比值高糖组与正常组相比在24h、48h、72h均显著降低，说明 MMPs和TIMPs的比值变化是维持正常基质成分的重要因素，随着高糖培养时间的延长，MMP-9／TIMP-1的比值改变在参与系膜细胞降解能力降低，细胞外基质增加中发挥着更重要的作用，对于高糖下是通过何种途径影响系膜细胞 MMP-9、TIMP-1表达的，有待进一步研究。

［1］SV McLennan，DJ Kelly，M Schache，et al.Advanced glycation end products decreasemesangial cell MMP-7：A role in matrix accumulation in diabetic nephropathy？Kidney International，2007（72）：481-488

［2］Shuichi Ohtomo，Masaomi Nangaku，Yuko Izuhara，et al.The role of megsin，a serine protease in hibitor，in diabetic mesangial matrix accumulation.Kidney International，2008，74：768-774

［3］尹燕志，张李梅，鞠建伟，等.人肾小球系膜细胞原代培养方法的改进.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（11）：1939-1942

［4］Singh R，Song RH，Alavi N，et al.High glucose decreases matrix Metallop-roteinase-2activity in rat mesangial cells via transforming growth Factor-betal.Exp Nephrol，2001，9（4）：249-257

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［6］Qi W，Poronnik P，Young B，et al.Human cortical fibroblast responses to high glucose and hypoxia.Nephron Physiol，2004，96（4）：121-129

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图 版 说 明

图1 人肾小球系膜细胞原代培养第21天（×100）。

图2 原代培养的肾小球系膜细胞α-肌动蛋白表达阳性（×400）。

图3 原代培养的肾小球系膜细胞抗平滑肌肌球蛋白表达阳性（×400）。

图4 原代培养的肾小球系膜细胞结蛋白表达阳性（×400）。

图5 原代培养的肾小球系膜细胞波形蛋白表达阳性（×400）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Human glomerular mesangial cells primary cultured at day 21（×100）.

Fig.2 Primary cultured human glomerular mesangial cells showingα-smooth positive cells（×400）.

Fig.3 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing anti-myosin positive cells（×400）.

Fig.4 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing desmin positive cells（×400）.

Fig.5 Primary cultured human glomerular mesangial cells showing vimentin positive cells（×400）.

Effects of high glucose on the expression of MMP-9and TIMP-1 in primary cultured human mesangial cells

Yin Yanzhi1，Mu Shouhan1，Ju Jianwei1＊，Lv Congkui1，Sun Xiaoyan1，Deng Leixiu2
（1Yantai Economy Technology Development Zone Hospital，Yantai 264006；2Shandong Simcere-Medgenn Bio-pharmaceutical Company，Yantai 264003，China）

Objective To observe the effect of high glucose on the expression of MMP-9，TIMP-1and the ratio of MMP-9／TIMP-1in primary cultured human mesangial cells，and to elucidate their possible roles in diabetic nephropathy.Methods Kidneys isolated from voluntary induced of labor with water bag were cut into pieces，and human mesangial cells were cultured with the method of renal cortical tissue combined with eugenic selection.Then ELISA was used to measure the expression of MMP-9and TIMP-1.Results Compared with that of the normal group，the expression of MMP-9in the high glucose group was significantly lower at 24h，48hand 72h（P＜0.01）；TIMP-1was higher at 24hand 72hand lower at 48h（P ＜0.05）；but the ratio of MMP-9／TIMP-1was decreased constantly at 24h，48hand 72h（P＜0.01）.Conclusion High glucose decreases the ratio of MMP-9／TIMP-1in mesangial cells in vitro，which may contribute to the inhibition of ECM degradation in glomerulus.

Human mesangial cells；Primary culture；Matrixmetalloproteinase-9；Tissue inhibitor of metalloproteinases-1；High glucose

R363

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.018

2011-05-24

2011-08-26

尹燕志，男（1977年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）