许立莉 李 淼 杜明伟 陈江帆 李建华

痰液肺癌细胞Ras基因和P63基因的表达与分子生物学意义

许立莉1李 淼2杜明伟1陈江帆1李建华＊

（1中国医科大学附属第一医院病理科暨中国医科大学病理教研室，沈阳110001；2辽宁中医药大学附属第二医院病理科，沈阳110034）

目的 研究骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中Notch表达的研究。方法 别用免疫细胞化学方法和Western-blot方法检测167例患者痰液中Ras基因和P63基因的表达情况，分析其对早期肺癌诊断的意义。结果 肺癌患者痰液中的Ras基因在痰脱落细胞中有明显高表达，阳性率为75%。P63基因在肺癌痰细胞中阳性表达率为34.78%。结论利用Ras基因标记物可以标记出痰液中的肺非典型增生细胞和肺癌细胞，有利于肺癌的早期发现和诊断，并且可以作为肺癌的普查指标或手段。

肺癌；Ras基因；P63基因；痰；液基

我国肺癌的发病率和死亡率一直呈上升和年轻化趋势，早期诊断对于肺癌的治疗和预后意义重大。目前，Ras基因突变引起肿瘤的关注度较高，作为一种癌基因在非恶性肿瘤细胞中处于抑制状态，从而使细胞增殖处于一种动态平衡而维持其正常增殖状况，当其激活使得细胞动态平衡发生改变既可引起细胞恶变。

P63对肺鳞状细胞癌的诊断及鉴别诊断有重要价值，尤其对于微小活检标本，联合应用可提高诊断正确率［1］。刘建等［2］研究发现，P63基因在肺鳞状细胞癌与其他类型的癌之间表达差异是显著的，可以作为鉴别肺鳞癌与其他类型癌的重要指标。二者联合使用应可以判断肺癌细胞起源，探索肺癌的发展趋势及治疗方案。

本研究是应用免疫组化和 Western-blot方法，检测痰液中难以明确诊断的肺非典型增生细胞以及肺癌细胞Ras基因表达变化或差异对比，探讨能否提高早期肺癌细胞诊断率以及P63基因与Ras基因二者联合应用对肺癌分型的意义。

材料和方法

1.研究对象

收集中国医科大学附属第一医院2007年1月至2009年12月门诊及病房患者痰液标本5386例，除去细胞数较少或无，采集前6个月接受过治疗及诊断不明的标本，对痰液非典型增生细胞和癌细胞随机提取，共147例，另外20例良性痰液标本（诊断为炎性或结核）作为对照。男性患者116例，女性患者51例；年龄24-87岁，年龄小于等于40岁者23例，大于40岁者144例，全部病例经临床、CT、磁共振及细胞病理学诊断。

2.试剂

ras基因鼠抗人单克隆抗体，P63基因鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗购自北京中杉生物技术有限公司。

3.切片的制备

收集的167例痰标本采用液基细胞薄层方法（TCT）常规制片、诊断后，经95%乙醇固定24h后石蜡包埋、切片。每份标本切片分别用做HE染色、CK19、CKH、CK7、TTF-1目的确定肺源性上皮癌细胞以及Ras基因、P63基因免疫细胞化学染色。

4.实验方法

4.1 液基细胞薄层检测技术（TCT）：

将痰液直接加入30ml清洗液和7-8滴消化液（1，4-二硫苏糖醇）后振荡约10min。离心，800转／分，5min。弃上清液，将少许沉淀加入到盛有保存液的小瓶中，静置10min后，用Thin Prep制成薄层细胞涂片，95%的酒精固定10min，巴氏染色。

4.2 免疫细胞化学技术：采用液基细胞薄层方法（TCT）常规制片、诊断后，挑选细胞量多的阳性标本，常规石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法（streptavidin-peroxidase，S-P）进行免疫细胞化学染色：切片常规烤片，脱蜡，水化；0.01mol／L柠檬酸盐缓冲液高温高压抗原修复20min；内源性过氧化物酶阻断溶液37℃下孵育30min；非免疫性动物血清37℃下孵育40min；一抗4℃下孵育过夜，Ras稀释比例为1：50.生物素标记的二抗37℃下孵育30min；链霉素亲和素过氧化物酶溶液37℃下孵育30min；新配置的DAB溶液显色；苏木素复染，中性树胶封片。各步之间用PBS（PH＝7.4）冲洗三次 ，每次5min。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性肺癌切片作阳性对照。

免疫细胞化学结果判定标准：细胞核中出现棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞，每张切片在光镜下随机选取5个视野，每个视野计数100个瘤细胞，着色强度分为无色为0分，浅黄色或黄色为1分，棕黄色为2分。阳性细胞数分为＜10%为0分，10%-50%为1分，＞50%为2分，两项得分相乘结果＞2记为阳性（＋），＜2为阴性。

4.3 Western-blot技术 总蛋白从痰脱落细胞中提取，冰上超生处理，4℃ 静置，孵育50min，4℃ 离心20min（1000r／min），提取上清，用Brodford法测定蛋白浓度，以每孔80μg蛋白加入10%SDSPAGE凝胶电泳后，4℃ ，50V条件下湿电转移仪将蛋白转入0.22μmPVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭2h，在分子量为18-25附近剪开PVDF膜孵育一抗（Ras 1：50稀释）4℃过夜，ECL显影，定影后拍照 。

5.统计学分析

应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用χ2检验（不满条件时用Fisher确切概率法）分析各组计数资料，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Ras基因在肺癌患者痰中 Western-blot结果显示

Ras基因在肺癌患者可见有特异性条带，2号条带为多次送检标本，痰液内所含癌细胞量多，Ras基因的表达明显增高，如图1所示。

图1 肺癌患者镇南关Ras基因的表达Fig.1 Expression of Ras in patients of lung cancer

2.免疫组化结果

我们首先通过液基薄层细胞涂片（TCT）筛查，筛选出痰中可疑肿瘤细胞的标本，对可疑病例做石蜡细胞包埋切片（HE），对于基本上可以确定为恶性的痰细胞标本，进一步做免疫组化，TTF1和CK19二者石蜡包埋切片免疫细胞化学染色呈强阳性表达，可以确定为肺癌痰腺癌细胞（如图2所示）。

2.1 用免疫细胞化学方法检测167例患者痰液。

Ras基因在肺癌痰腺癌细胞细胞膜阳性表达。

P63基因在肺癌痰腺癌细胞细胞膜阳性表达，在肺癌痰鳞癌细胞细胞核阳性表达。

2.2 免疫组化Ras基因的表达与临床病理学参数的关系（表1）。

Ras基因在良性对照、非典型增生细胞、癌细胞的痰标本内的表达率分别为0%、75%、72.73%，差异具有统计学意义（P＜0.01＊）。Ras基因在腺癌、混合型癌、鳞癌的痰标本内的表达率分别为74.6%、76%、75%，差异无统计学意义（P＞0.25）。Ras基因在≤40岁患者阳性率为60.87%，＞40岁阳性患者表达率为65.97%，差异无统计学意义（P＞0.5）。Ras基因男性患者的阳性率为68.10%，女性患者的阳性率为58.82%，差异无统计学意义（P＞0.25）。

表1 Ras基因的表达与临床病理学参数的关系Table 1 The relationship of expression of Ras gene with clinicopathological parameters

2.3 免疫组化P63基因的表达与临床病理学参数的关系（表2）。

P63基因在良性对照、非典型增生、癌细胞的痰标本内的表达率分别为0%、34.78%、18.18%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。P63基因在腺癌、混合型癌、鳞癌的痰标本内的表达率分别为38.1%、32%、50%，差异无统计学意义（P＞0.1）。P63基因在小于等于40岁患者阳性率为60.87%，大于40岁患者阳性表达率为19.44%，差异有统计学意义（P＜0.005）。P63基因男性患者的阳性率为24.14%，女性患者的阳性率为27.45%，差异无统计学意义（P＞0.75）。

表2 P63基因的表达与临床病理学参数的关系Table 2 The relationship of expression of P63gene with clinicopathological parameters

表3 Ras基因与P63基因联合在肺癌痰细胞的表达Table 3The expression of Ras gene and P63 gene in lung cancer sputum cell

4.P63基因在大部分肺腺癌细胞内呈细胞膜阳性表达

Ras基因在早期肺癌患者痰标本内既有高表达，对肺癌早期诊断具有重要意义，可以作为痰液基细胞肺癌诊断的标记物，用于早期肺癌的诊断及防癌普查，本实验中P63基因对于早期肺癌诊断的意义不显著，有待于深入研究。

讨 论

肺癌是目前全球头号杀手，世界每年平均约有100万人死于肺癌，肺癌以每年0.5%的速度增长，发病率占全部癌症的11.3%，死亡率占全部癌症的18%，而中国是世界上肺癌患者最多的国家，我国肺癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势，每年增长率为4.7%，高于世界年平均增长水平近50倍。其中早期诊断的肺癌患者5年存活率可达到60-90%［3］，然目前我国肺癌的早诊率仅为15%，肺癌患者约75%在就诊时已处于晚期，尽管已有许多先进的治疗方法，晚期肺癌患者5年生存率仍不到15%。更重要的是目前肺癌患者正在向年轻化发展，本组试验中40岁以下患者占13.8%。不能对疑似肺癌的患者进行手术取组织标本，多种早期肺癌诊断方法比较，自体荧光支气管镜（AFB）与白光支气管镜（WLB）联合运用其敏感性为82.3%，特异性58.4%。痰液检测的敏感度为65%，特异性可达到80%以上，因此痰液检查是肺癌普查和早期诊断的最佳方法。

痰是肺癌早期诊断的病理标本中取材最容易获得的标本，可以在肺癌发生的早期就获得，而且痰标本的取得安全无痛，可操作性强，最容易得到患者的配合。近年开展的液基薄层染色技术在制做痰涂片时消除了粘液等杂质的影响，同时单层涂片消除了炎细胞的干扰，使背景清晰，细胞量大幅增加，是目前大力推广的肺癌早期检查方法。研究表明，痰细胞中出现的分子细胞学异常在对应的肿瘤组织中均可检测到，在郭秀娟等［4］的前瞻性研究中发现，具有痰细胞分子细胞学异常改变的非肺癌病人，一般均可能发展成为肺癌，这无疑为利用痰细胞进行肺癌分子诊断奠定了基础。

ras基因是具有重要生理功能的编码基因，家族成员包括大约50个相关的编码基因GTP-binding参与信号转导，其中主要基因为H-ras、K-ras和N-ras。在大量相关研究中Ras基因是肺癌早期诊断的典型标记物，在肺癌早期既有高表达，本试验检测出Ras基因在肺非典型增生细胞、癌细胞的痰标本内的表达率分别为75%、72.73%。Ras基因在非典型增生细胞内的高表达，与谭敏等［10］研究结果相同，提示ras基因的突变是在肺癌的形成过程中即已发生，是肺癌发生的早期事件，图片3：细胞学图片初诊时认定为异型增生，后经RAS基因细胞免疫化学证实为鳞癌细胞，组织病理学得已认证。在肺癌高危人群的大量筛查及肺癌早期诊断中具有重要意义，通过筛查ras基因可以提高痰的肺癌早期检出率。本实验用 Western-blot方法检测出恶性痰液内Ras基因有高表达，结果显示痰液内所含肺癌细胞越多，则Ras基因的表达越强（图1）。本组免疫组化结果证实Ras基因在肺癌患者的表达与年龄、性别、细胞分化程度无显著关系，没有统计学意义P＞0.05（表1），这与陈萍等［11］的研究结果相同。Ras基因突变率在腺癌中最高，分别于鳞癌和小细胞癌之间存在显著性差异（P＜0.05），在鳞癌与小细胞癌之间无显著差异［12■。本组实验Ras基因在肺腺癌、鳞癌、混合型癌无显著关系，没有统计学意义P＞0.05（表1），可能与本组实验鳞癌例数过少有关。

P63基因是P53家族的新成员，其表达直接或间接影响细胞的增殖活性［5］。P63基因的生物学功能体现在指导转录调控、参与细胞调控及凋亡、在表皮发育中起作用、与衰老及肿瘤发生的关系等方面［6］。本组实验显示，P63基因在年龄大于40岁肺癌患者的阳性率低于小于40岁的阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05），此结果提示P63基因表达增殖细胞，随着细胞的衰老P63表达减弱（表2）。P63基因在肺癌痰细胞中的表达与性别和病理分型无显著关系。研究发现，P63在原发性肺癌主要表达与鳞状细胞癌的癌细胞中，在肺鳞癌中阳性表达率均高于90%［7-9］。然P63基因在本组4例鳞癌中仅有2例阳性表达，可能与本组鳞癌例数过少有关系。

目前，早期肺癌痰的阳性检出率应可达到60%-80%，但痰的实际阳性检出率仅为8%-19.6%。中国医科大学附属一院近3年痰瘤细胞的阳性检出率分别为：2007年30.20%、2008年22.28%、2009年20.07%。阳性检出率较低，并不代表阳性率低，很多增生伴有癌变，肺癌早期的症状轻，就诊的患者少，且分化高的肿瘤细胞不易与增生区别，造成很多细胞学医生对于早期肺癌的细胞形态认识不清，认识的都是中晚期。因此，应侧重早期肺癌的诊断，找到高效率的特异性指标，进行分子生物学筛查，以提高癌前病变的诊断率为发展方向。

肺癌的治疗方法越来越先进，根据治疗的需要寻找早期肺癌的诊断方法是肺癌早期诊断的另一个发展方向。用痰液分析与肺癌相关的microRNA才刚刚起步，寻找痰液中与肺癌相关的microRNA分子将会给肺癌的早期发现和早期治疗及合理治疗创造新的机会。Ras基因作为一种癌基因在非恶性肿瘤细胞中处于抑制状态，当其激活使得细胞动态平衡发生改变既可引起细胞恶变。耶鲁大学的研究发现mrioRNA通过与Ras信息结合来调节Ras，并可能抑制Ras蛋白的翻译。MicroRNA不能将突变的Ras基因变回正常，但它能充当一个被"加速"的Ras的"刹车"。由此可见，Ras基因不仅在肺癌早期诊断有重要意义，对肺癌的的治疗提供了更新更有效的方法。

P63在本组实验内阳性率低于Ras基因，且其在腺癌中多为细胞膜阳性表达，组织标本亦有相同表达（图4）。目前纯鳞癌已经少见，P63基因与Ras基因二者均呈阳性多为混合型癌。

以上研究表明Ras基因不仅对肺癌早期诊断具有重要意义，可以用作早期肺癌筛查标记物，对于肺癌的治疗也有重要作用。肺鳞癌患者在临床检出前3年即可出现分子生物学异常现象，P63基因转录产物在上皮性肿瘤的发生、发展中具有的双向作用，对于肿瘤的预防和治疗有重大意义，而且P63基因是鳞状上皮增殖的特异性标记，其对于早期肺癌诊断的意义有待于深入研究。

［1］李永纯，杨虹，贺志力，等。P63在肺癌微小活检组织标本中的应用价值.诊断病理学杂志，2008，15（3）：191-193

［2］刘建，覃丹，颜桂芳.P63和TTF-1在肺癌组织中的表达意义.中国组织学与细胞学杂志，2008，17（3）：289-291

［3］张利平，姚群峰，宁勇.p16、MGMT甲基化在肺癌早期断诊中意义.中国公共卫生，2008，24（1）：52-53

［4］郭秀娟，沈莉.痰标本P16基因启动子区甲基化联合血清细胞蛋白19片段和癌抗原15-3对非小细胞肺癌的诊断价值.临床荟萃，2008，23（15）：1067-1070

［5］罗志刚，王一，宝建中。P63和P53及PCNA在肺癌中的表达及意义.中国肿瘤临床与康复，2008，15（1）：25-32

［6］Bokhoven H，Brunner HG.Splitting p63.Am J Hum Genet，2002，71（1）1-13

［7］陈寿松，肖同浩，陈晰薇，等。Cox-2、P63蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义.第三军医大学学报，2008，30（7）：628-630

［8］Wu M，Wang B，Gil J，et al.P63and TTF-1immunostaining A usefulmarkerpanel for distinguishing small cell carcinoma of lung from poorly differentiated squamous cell carcinoma of lung.Am J clin Path，2003，119（5）：696-702

［9］谭敏，宾晓农，等。痰脱落细胞ras基因突变在肺癌诊断中的意义.国际医学卫生导报，2007，13（14）：4-7

［10］Zhang H，Liu J，Cagel PT，et al.Distinction of pulmonary small cell carcinoma from pooly differentiated squamous cell carcinoma：an immunohistochem ical approach.Mod Pathol，2005，18（1）：111-118.

［11］陈萍，史卫林，李坚，等。非小细胞肺癌K-ras基因点突变的研究，2008，48（34）：7-9

［12］陈宏，陈复辉，肖金玲，等。肺癌患者痰、BALF及肺癌组织中检测K-ras和P53基因突变的诊断价值.哈尔滨医科大学学报，2007，41（4）：382-384

图 版 说 明

图2 A：肺癌痰腺癌细胞液基薄层涂片（TCT）×600；B：肺癌痰腺癌细胞石蜡包埋切片（HE）×600；C：免疫细胞化学染色，CK19在肺癌痰腺癌细胞中阳性表达 ×600；D：免疫细胞化学染色，TTF-1肺癌痰腺癌细胞阳性表达×600

图3 E：免疫细胞化学染色，Ras基因在肺癌痰腺癌细胞阳性表达 ×600；F：免疫细胞化学染色，P63基因在肺癌痰腺癌细胞阳性表达×600；G：免疫细胞化学染色，Ras基因在肺癌痰鳞癌细胞中阳性表达 ×400；H：免疫细胞化学染色，P63基因在肺癌痰鳞癌细胞阳性表达×600

图4 I：P63在肺癌痰腺癌细胞细胞膜阳性表达×400；J：P63在肺腺癌组织细胞膜阳性表达×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.2 A：Adenocarcinoma cell of sputum（TCT）×600；B：Adenocarcinoma cell of sputum（HE）×600 ；C：IHC-Strong membrane staining of CK19in adenocarcinoma cells from sputum×600；D：IHC-Strong nucleus staining of TTF-1in adenocarcinoma cells from sputum×600

Fig.3 E：IHC-Strong membrane staining of Ras in adenocarcinoma cells from sputum ×600；F：IHC-Strong nucleus staining of P63in adenocarcinoma cells from sputum ×600；G：IHC-Strong membrane staining of Ras gene in squamous cell carcinoma cells from sputum ×200；H：IHC-Strong nucleus staining of P63，gene in squamous cell carcinoma cells from sputum ×600

Fig.4 I：IHC-Strong membrane staining of P63in adenocarcinoma cells from sputum ×600；J：IHC-Strong membrane staining of P63in adenocarcinoma cells from tissue×200

Molecular biological observation and study of lung cancer cells from sputum

Xu Lili1，Limiao2，Du Mingwei1，Chen JiangFan1，Li Jianhua＊
（1Department of Pathology，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang110001，China ；2Department of Pathology，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine；Shenyang110034，China）

Objective To investigate the value of the Ras gene in sputum cells in the diagnosis of lung cancer，and the diagnostic value of combination detection of Ras and P63genes in lung cancer.Methods The expression of Ras and P63genes in sputum was detected by immuncytochemistry and Western-blot method，and its meaning for the early diagnosis of lung cancer was analyzed.Results 75%lung cancer cells showed Ras gene mutation，much higher than in normal cells（P＜0.05）.34.78%lung cancer cells showed P63gene mutation，also higher than in normal sputum cell（P＜0.05）.Conclusion The Ras gene can be used to label suspicious and early cancerous cells in the sputums for the early diagnosis of lung cancer.

Lung cancer；Ras genes；P63genes；Sputum；Thin prep

R349.5

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.017

2011-06-14

2011-09-15

国家自然科学基金（30801131）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（200804861045）

许立莉，女（1977年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）