浙江汉族人群HLAⅠ类基因多态性初步分析

2011-12-13戴卫健李萌朱发明严力行

中华移植杂志(电子版) 2011年2期

关键词：浙江

戴卫健李萌朱发明严力行

HLA基因具有高度的多态性，在不同地区、不同民族人群中，该基因及单倍型频率分布存在显著的差异。HLA多态性分析有助于提高器官移植供受者间配型成功率［1］。本研究采用PCR测序分型法分析浙江汉族人群HLA-A、B和C位点的等位基因及其单倍型，为非血缘关系器官移植配型、法医鉴定、个体识别等研究积累资料。

1 材料与方法

1．1 材料

浙江地区健康、无血缘关系的汉族无偿献血者100名，经其知情同意后，采集外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

1．2 方法

采用血液基因组DNA抽提试剂盒(PEL-FREEZ公司，美国)进行基因组DNA抽提，严格按试剂说明进行操作。紫外分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA纯度和浓度，－20℃保存。然后，扩增HLA-A、B和C基因组全长序列，扩增引物由上海英俊生物有限公司合成，引物序列见表1。扩增反应体系为25μL，其中含10×PCR缓冲液2．5μL，DNA模板约100 ng，LA TaqDNA 聚合酶1．0 U，dNTP、氯化镁溶液终浓度分别为0．2 mmol/L和1．25 mmol/L，引物终浓度为0．3μmol/L。扩增条件为95℃预变性5 min;95 ℃ 30 s，67 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35 个循环;72℃延伸10 min。之后，往每管PCR产物中加入核酸外切酶Ⅰ1μL(2 U)和碱性磷酸酶2μL(10 U)［宝生物工程(大连)有限公司］，在9700型PCR自动扩增仪(ABI公司，美国)上进行酶切，37℃ 30 min，80℃ 15 min，以纯化PCR产物。再以纯化PCR产物为模板，按照BigDye测序试剂盒(ABI公司，美国)操作说明进行双向测序，测序引物序列见表2。测序反应条件为95℃预变性5 min;95℃ 30 s，47℃45 s，60℃ 4 min，35个循环;冷却至4℃保存。测序结果采用Assign 3．5软件进行分析。