王 艳，林礼务，陈志奎，薛恩生，杨 菁，俞丽云

眼镜蛇毒是一类天然毒性物质，含有多种蛋白质、多肽、酶类等，具有广泛的生物学活性。其中眼镜蛇毒细胞毒素(cobra venom cytotoxin，CTX)是眼镜蛇毒的主要成分之一，是一类既具有心脏毒性，又具有细胞毒性尤其是对肿瘤细胞有毒性的组分，在抗肿瘤方面具有一定的应用前景。诱导肿瘤细胞凋亡是许多化疗药物发挥抗肿瘤作用的主要机制。我们采用CTX在体外作用于人肝癌细胞BEL-7404，从分子水平观察CTX对人肝癌细胞的凋亡作用以及对线粒体及细胞质细胞色素C的影响，探讨CTX的抗癌机制，从而为CTX治疗肝癌提供更充足的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人肝癌细胞系BEL-7404(由福建省肝胆外科研究所惠赠)。

1.1.2 主要试剂 CTX由本研究所从中华眼镜蛇毒粗毒(广州新源蛇毒公司)中分离纯化而得［1］;BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物技术公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(Gibco公司);小鼠抗人Cytochrome C，β-actin单克隆抗体，兔抗人 caspase-3、-9多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠二抗、兔抗小鼠二抗(Santa Cruz公司产品);caspase-3、-9活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所产品)。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖试验与光镜观察 将BEL-7404细胞制备成单细胞悬液，以1×109·L－1浓度接种于96孔板(每孔100 μl)，每孔加入用完全培养基配制成终浓度为0.5、1、2 和3 mg·L－1的眼镜蛇毒细胞毒素200 μl，对照组加入等量完全培养液，每个药物浓度设3个平行孔，药物作用12、24和48 h后，MTT法［2］检测细胞增殖活性，并计算细胞增殖抑制率(%)和半数抑制浓度(IC50)。……