肖萍萍，陈君敏，叶德富

二膦酸盐是治疗骨髓瘤骨病(MBD)的主要药物，已有的证据认为二膦酸盐抑制破骨细胞(OC)前体增殖，抑制OC形成并诱导凋亡。但近年来研究发现二膦酸盐还能促进成骨细胞(OB)的增殖分化。二膦酸盐治疗MBD的作用是否通过改变细胞核因子κ-B受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor κ-B ligand，RANKL)和护骨素(osteoprotegerin，OPG)表达水平，目前看法不一。为进一步了解二膦酸盐治疗MBD的机制，我们在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者从骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)诱导分化的 OB加入唑来膦酸(zoledronic acid，第3代二膦酸盐)，考察其对OB增殖及OB表达RANKL和OPG的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 低糖DMEM培养基干粉和0.0025胰蛋白酶均购自Gibco公司，人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品有限责任公司)，新生胎牛血清(Hyclone公司)，青、链霉素(Hyclone公司)，地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C均购自美国 Sigma公司，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Cell Counting kit(CCK-8，同仁化学研究所)，唑来膦酸(北京诺华制药有限公司)，引物合成(上海生工)，TRIzol液(Tri Reagent公司)，cDNA第一链合成试剂盒(RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit#K1622，Fermentas公司)，PCR Master Mix(厦门泰京生物工程有限公司)，sRANKL ELISA Kit(美国 ADL公司)，OPG ELISA Kit(美国ADL公司)。

1.2 方法

1.2.1 人BMSCs分离培养及诱导形成OB 骨髓标本取自5例多发性骨髓瘤患者，密度梯度离心法分离单个核细胞，调整细胞密度为109·L－1，接种于25 cm2培养瓶，放入37℃，0.05 CO2培养箱，培养5 d后首次换液，以后每3天换液，每日倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。当细胞汇合到70%～80%时(约2周)，用0.0025胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代。本实验采用Kadiyala等［1］建立的OB诱导方法，将培养至第3代(约20 d)BMSCs采用条件培养基(维生素C 50 mg·L－1、地塞米松10－8mol·L－1和 β-甘油磷酸钠 10 mmol·L－1的低糖DMEM)培养基培养，采用碱性磷酸酶染色及钙结节等鉴定确认为OB。……