许 杰,闫秋月,湛彦强,张苏明

华中科技大学附属同济医院神经内科武汉 430030

#通讯作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干细胞再生与脑血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

小鼠微小 RNA294逆转录病毒载体的构建及鉴定＊

许 杰,闫秋月,湛彦强,张苏明#

华中科技大学附属同济医院神经内科武汉 430030

#通讯作者,男,1952年 1月生,博士,教授,研究方向:干细胞再生与脑血管疾病,E-mail:huaxinxiaoqu@126.com

微小RNA;细胞重编程;逆转录病毒载体;小鼠

目的:构建小鼠微小 RNA294(miR-294)逆转录病毒载体。方法:从小鼠基因组 DNA扩增 pri-miR-294,克隆连接至pMX-IRES-GFP逆转录病毒载体上,得 pMX-miR-294-I RES-GFP,测序鉴定后以转染 PLAT-E细胞进行病毒包装,测定病毒滴度。结果:pMX-miR-294-IRES-GFP经 PCR扩增及测序鉴定正确,并得到了滴度为 (1～5)× 106TU/mL的病毒液。结论:成功构建了 pMX-miR-294-I RES-GFP逆转录病毒载体。

微小RNA(microRNA,miRNA)和诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是目前生物学领域的两个前沿。研究[1]表明,miRNA在动植物体内参与调控干细胞特性,并参与细胞生长、分化和凋亡,在胚胎发育过程中发挥着极其重要的调控作用。miRNA-290(miR-290)簇在小鼠胚胎干细胞多能性的维持方面发挥着重要作用,其中一些亚型对胚胎干细胞的细胞周期调控起着无可替代的作用,包括miR-291-3p、miR-294和miR-295,故被称为胚胎干细胞细胞周期调控特异性 miRNA[2]。iPSCs的诱导目前多侧重于基因和转录因子的研究,至于miRNA在 iPSCs的诱导过程中是否发挥作用目前仍不清楚。作者构建了miR-294逆转录病毒载体,用于研究miR-294在 iPSCs诱导过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 动物与质粒:孕 12.5 d昆明小鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供;pMXI RES-GFP逆转录病毒载体由第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室韩骅教授惠赠。……