赵晶，孟令章，陶钧，肖瑶，邢文革

分子流行病学是应用先进的技术检测生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程，并研究疾病的防治和促进健康的策略和措施的科学。自1989年美国学者 Choo等[1]应用分子克隆技术首先发现丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）以来，HCV的分子生物学、病毒分型、HCV感染的流行特征及与临床关系等方面的研究都取得了很大进展。以 HCV的基因分型作为生物标志（biomarkers）进行的分子流行病学研究对 HCV 感染、传播、诊断、治疗及预防等方面均有重要意义。本文就 HCV的分型和分子流行病学国内外研究进展等方面进行综述。

1 HCV 分型的研究进展

1.1 HCV的分型依据

HCV 具有显著异源性和高度可变性。对已知全部基因组序列的HCV 株进行分析比较，其核苷酸和氨基酸序列存在较大差异，HCV 基因组各部位的变异程度不相一致，如5’-NCR 最保守，同源性在92%～100%，而 3’-NCR 区变异程度较高。在HCV的编码基因中，C 区最保守，非结构（NS）区次之，囊膜蛋白 E2/NS1 编码区可变性最高，称为高可变区。

根据现有的HCV 分离株数据，HCV 基因多样性主要表现在4个水平：①HCV 基因组的核苷酸序列变异 31%～33% 时，定为基因型；②基因组的核苷酸变异 20%～25%定为基因亚型；③HCV 基因组的核苷酸变异超过 10% 定为分离株；④感染者体内可同时存在不同的多种序列组成，但却有很高同源性（同源性 ≥ 95%）的HCV 变异株群体称为准种（quasispecies）[2]。

1.2 HCV 基因分型系统概况

目前至少有 4 种不同的HCV 基因型命名系统[3]，分别为Okomoto 系统、Cha 系统、Kanazawa 系统和Simmonds 系统。1993年Simmonds 依据不同病毒毒株编码非结构蛋白 5（NS5）区域核苷酸序列的同源性，按照发现的先后将 HCV 分为1～6个型和11个主要的亚型，亚型以 a、b、c等表示[4]。该分型方法得到了大多数学者的认同。该分型法能与先前的各种分型命名法相对应，不仅协调了以前的分型命名方法，而且可以在多种分型系统中命名新的型和亚型。不同分型系统之间的对应关系见表1。

1.3 HCV 分型方法研究进展

目前 HCV 分型有多种方法，如：血清学分型法、核酸序列分析法、型特异性引物扩增分型、型特异探针杂交分型法和限制性长度多态性分析法（RFLP）等。

表1 HCV 基因型各种分型之间的对应关系

1.3.1 血清学分型 HCV 血清学分型技术是根据 HCV某些区域表达抗原具有与基因型对应的型别差异，合成特异性多肽作为包被抗原，对 HCV 血清抗体进行分型检测。Murex HCV 血清分型试剂盒针对 HCV NS4 区的特异性抗体，对 HCV 进行血清学分型。Murex HCV 血清分型实验虽不能区分亚型，但其分型结果对临床治疗具有一定指导作用[5]。

1.3.2 核酸序列分析法 随着核酸测序技术的发展，直接测序分型成为目前具有推广潜力的HCV 基因型检测方法。该方法需要对 HCV RNA 进行巢式 PCR 扩增，它使用两对引物，进行两次 PCR 反应，能够极大地增加 PCR 扩增反应的敏感性和特异性。套式 PCR 第二次反应的引物（内引物）位于第一次 PCR 扩增区域内。外引物进行第一次PCR 扩增后，将扩增产物转移至第二次 PCR 反应管内，使用一对内引物进行第二次 PCR 扩增反应，最后用凝胶电泳鉴定扩增产物并测序。HCV的核酸序列分析法是 HCV分型中最经典、最可靠的分型方法，许多其他的分型方法都将序列分型作为参考标准。

1.3.3 型特异性引物扩增分型 根据不同 HCV 基因型在某一区段（主要是保守区）序列的差异，设计一系列型特异性引物。不同 HCV 基因型可扩增出长度大小不同的片段，并以此分型。这个方法是目前国内外学者较为广泛应用的方法。他们分别根据各自地区需要区分的不同型别的HCV 基因序列设计了 5’NTR 区、C 区、NS5B 区的特异性引物，将该地区的基因型及亚型很好地分开。此方法由于不同学者采用的设计引物的基因型不同，设计引物的区域不同，想要进行 HCV 基因分型的型别不同，采用的引物和引物数目各不相同，因此不利于结果间的比较。

1.3.4 型特异探针杂交分型 通过生物素标记的引物扩增HCV 病毒基因组中 5’非翻译区的保守序列，利用固定于膜上的型特异性探针与扩增产物进行杂交，通过互补结合后，可直接与链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物结合，再通过底物作用而在相应的探针位置出现杂交信号，即可以此进行结果判断[6]。该方法敏感性高、特异性强、杂交信号明显、结果易判断，且能区分多种基因型，是较为理想、方便、实用的分型方法。

应用此原理的目前较广泛使用的是 LiPA HCV 基因分型 2.0 试剂盒。相比第一代产品，二代 LiPA HCV 增加了核心区序列，可准确地区分 1a和1b 型，并可避免东南亚地区和我国南部地区较常见的6c-6l 型被误分为1 型，但仍约有 8%的2a 型易被误判为1a 型，而这两种型别的HCV 感染的治疗和预后均存在较大差异。需要注意，LiPA要经过 PCR 扩增，对 HCV 混合感染进行分型时，不可避免会因不同型别 RNA 扩增效率不一造成的劣势扩增毒株的漏检。

1.3.5 限制性长度多态性分析法（restriction fragment length polymorphisms，RFLP） HCV 不同基因型某一区段个别碱基的变异可直接导致某些酶切位点的改变。RFLP 法一般选 5’NTR 区和NS5B 区作为RFLP 分型的靶基因。PCR 扩增靶基因得到的产物用不同的限制性内切酶进行酶切，不同型或亚型得到不同长度大小的片段，然后根据酶切后电泳所表现的片段大小及多态性进行基因分型。

2 HCV 分子流行病学研究进展

2.1 HCV 基因型的地区分布特征

目前已经发现了 HCV 有 6 种基因型和上百种基因亚型。研究表明，HCV 基因亚型的分布与地区有关。1a、1b、2a、2b和3a 呈世界性分布，造成绝大多数的HCV 感染[7]。图 1 展示了 20 世纪部分国家和地区的HCV 流行的主要基因型或亚型[2]。图中 1a亚型流行于北欧、美国；1b亚型广泛分布于世界各个地区；2 型分布于地中海、东亚；3 型主要分布于欧洲；4 型分布于中东；5 型广泛分布于南非；6 型主要分布于中国香港、越南、澳大利亚。

按照地理位置由西向东，对近年来 HCV 基因亚型的地区分布的研究进展总结如下：西方国家共同的基因型 1 型（1a、1b）和2 型（2a、2b、2c）在过去的50～70年广泛分布于欧洲和北美洲，目前 1 型（1a、1b）仍为西欧和美国的主要亚型。地中海巴尔干半岛 1b亚型最高，同中欧、西欧的临界国情况相同，但是希腊除外（3a亚型最多）[8]。非洲的流行情况为：西非主要流行 2 型；中非（刚果共和国、加蓬共和国等）主要流行 1 型、4 型；北非（埃及）主要流行 4 型[9-12]。中东地区：阿拉伯国家主要流行 4 型，然而非阿拉伯国家主要流行 1a和1b 两种亚型[13]。亚洲国家以 1b亚型为主，2a亚型次之。东南亚主要流行 3 型和6 型。需要特别说明的是：撒哈拉以南非洲和东南亚 HCV亚型多样化，且出现较多的HCV亚型重组（原因可能为反复共用针具吸毒等）。由于基因亚型检测方法的局限，通常检测出的亚型为感染者体内的占优势的亚型。因此，对于如撒哈拉以南非洲和东南亚 HCV亚型多样化的地区，亚型检测不能准确描述个体的感染状况，而且在流行病学上的意义比较小。

图1 20 世纪部分国家和地区的HCV 流行的主要基因型或亚型

图2 HCV 数据库收录的中国 HCV 序列亚型构成比

对于中国 HCV 基因亚型的研究，以往诸多资料表明以1b和2a 两种亚型为主。近年来研究显示，在我国南方广西、武汉、贵州等省市吸毒人群中，6a亚型为主要亚型。图 2 展示了 HCV 数据库截止到 2010年7 月收录的中国 HCV 序列亚型的构成比[14]。根据数据库的说明，此图不能代表 HCV 各亚型在中国分布的真实构成比，但是在一定程度上可以反映出中国 HCV 基因型和亚型分布的概况。

2.2 HCV 基因型的时间分布特征

HCV 基因组突变率以（1.5～2.0）×10-3/（碱基×年）来算，HCV 基因型、亚型分别于500～2000年和100～300年前形成。根据各亚型进化的基因距离推论，1b亚型和2 型的进化时间较长，是古老的亚型，其他亚型进化时间较短。诸多研究结果显示，随着时间的推移，1b亚型和2 型有逐渐被其他亚型取代的趋势，如：巴基斯坦的3a亚型在20 世纪 20年代出现，在50年代开始快速增长；在法国 1983年后才出现 3 型，现在已成为该国的流行亚型，最近该国又出现 4 型和1a亚型大幅度上升而 lb亚型和2 型下降的现象；塞尔维亚的研究中，小于40 岁的年龄组3 型所占比例显著多于40 岁以上年龄组，且显示随时间推移 1b亚型所占比例降低；澳大利亚一篇研究汇总了 1996–1998年3年的亚型分布研究，可以看出1 型构成比例有降低的趋势，4 型有升高的趋势[15]。

近几十年，相对新的感染途径导致 HCV的快速传播[16-17]，如 20 世纪 40年代的不洁采血、共用注射器吸毒、用未经消毒的针头进行注射和接种疫苗。这可能是 HCV 基因亚型变化的内在根源，因为研究显示感染途径与亚型密切相关。在我国，有关 HCV 流行史的研究较少。随着感染时间的推移，人口的流动，主要感染途径的变化，HCV 基因亚型在我国的流行应该呈现出一定的变化趋势。HCV 分子流行病学的研究能够揭示 HCV 在我国流行的过程，从而对HCV的防控措施和疫苗的研究提供重要的依据。

2.3 HCV 基因型的人群分布特征

近年来对 HCV 传播途径的认识越来越清晰，大量的研究已证实，lb、2 型、5 型与输血、血制品或医院内传播有关，3a、1a、4 型、6 型与静脉吸毒（IDU）关系密切，而其他传播途径与HCV 基因型间无明显相关性[18]。其他研究表明：西方国家传播途径主要有经血传播、IDU、介入性治疗及手术；比利时的一项研究报道了如医疗职业暴露、纹身、有创身体装饰、母婴等传播途径；Okamoto 报告日本血友病患者约 50% 为1a亚型感染，原因是输入美国进口凝血因子 VIII；塞尔维亚的一项研究报道，肾透析病人和有很长 HCV 感染史的病人 HCV 不同基因型、亚型间的混合感染非常多[19]。

近年来诸多研究表明 IDU人群 HCV 感染率非常高，需要引起重视。Aceijas等[20]汇总了 1998–2005年的有关于IDU人群 HCV 感染的文献，包括了 57个国家，152个地区。HCV 感染率分别为：东欧中亚 10%～96%；南亚东南亚 10%～100%；东亚和太平洋 34%～93%；北非中东5%～60%；拉美 2%～100%；北美 8%～90%；澳大利亚、新西兰 25%～88%；西欧 2%～93%；只有哥伦比亚和黎巴嫩低于20%；中国、波兰、波多黎各、俄罗斯、西班牙、瑞士、泰国、越南的IDU人群 HIV/HCV 共感染率为90%。另有对中国 1997 - 2006年间的105 篇关于IDU人群 HCV 患病率研究的分析结果显示，中国 IDU人群的HCV 患病率为61.4%，感染最严重的省份和自治区为：湖北、云南、广西壮族自治区、湖南和新疆维吾尔自治区[21]。以上数据充分说明了对 IDU人群进行 HCV 普查的必要性，特别是 HIV 阳性的IDU人群。

3 HCV 分子流行病研究对于临床的意义

不同基因型对抗病毒治疗的应答不同，采取的治疗方案也不同，因此，基因型的测定有助于决定抗病毒疗程和药物剂量。根据临床研究结果，在1 型患者中建议疗程为1年，利巴韦林的用量要达到 1000～1200 mg/d，但是其持续病毒学应答（sustained virologic response，SVR）仅达到 40%～45%；而 2和3 型患者，疗程半年，利巴韦林的用量只要800 mg/d 即可达到 70%～80%的SVR，延长疗程或增加利巴韦林的用量都不能进一步提高持续病毒学应答率。根据不同的基因型调整疗程和利巴韦林的用药剂量，可以减少药物的浪费，减轻药物的不良反应，从而提高患者对治疗的依从性。

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