莫桂玲，胡朝晖，喻长顺，詹益鑫，朱庆义

假肥大型肌营养不良症（Duchenne/becker muscular dystrophy，DMD/BMD）是一种严重的神经肌肉疾病，它是由于DMD 基因突变导致的X连锁隐性致死性遗传病，目前尚无有效的治疗方法[1]。为提高检测 DMD 基因单个外显子缺失突变的准确率，避免将单个外显子的微小突变误判为缺失突变，为DMD 家系成员的遗传咨询和产前基因诊断提供准确的依据，本实验室通过多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、PCR 技术和基因测序方法的联合应用，对疑为DMD 基因单个外显子缺失的样本进行基因诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 研究对象为来自全国各医院神经科或儿科的患者，所有研究对象均签署知情同意书。

1.1.2 主要材料 阴性和阳性对照品采用美国病理学家协会（College of American Pathologists，CAP）的DNA 质控品。MLPA 检测试剂盒 SALSA MLPA kit P034-A2/P035-A2 DMD/Becker 购自荷兰MRC-Holland公司[2-3]；DNA 提取试剂盒 QIAamp DNA blood mini kit 购自德国 Qiagen公司；GeneAmp 9700 PCR 仪和genetic analyzer 3130xl毛细管电泳仪购自美国 ABI公司；Genescan-LIZ 500 ladder 为美国 ABI公司产品；DNA Marker（MD101-Marker I）购自天根生化科技（北京）有限公司；ActiTaq DNA Polymerase 为德国罗氏公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集及预处理 受试者安静状态下采集 EDTA 抗凝外周血 2～3ml。采用 QIAamp DNA blood mini kit DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，用紫外分光光度计测量提取 DNA 在260 nm和280 nm 下的吸光度 A260和A280计算A260/A280及DNA 浓度，确保 DNA 浓度在10～50 ng 之间，冷冻保存。受试样品共 185 例，为2009–2010年送本实验室进行 DMD 基因检测的血样。

1.2.2 MLPA 技术检测 参照 MLPA 检测试剂盒说明书，首先进行 PCR 扩增，反应结束后，取1 μl PCR 产物与0.5 μl Genescan-LIZ 500 ladder和8.5 μl Hi-Di 甲酰胺混合，置94 ℃ 4 min，冰浴 5 min，随后进行毛细管电泳 1 h，温度控制在60 ℃。每次 MLPA 检测都包含一个阳性对照（CAP2009MGL2-03）、一个空白对照、一个正常对照（CAP 2009MGL2-01）。使用 Coffalyser v9.4 软件进行结果分析。由于DMD 基因位于X 染色体上，男性患者如果缺失一个或多个外显子，经MLPA 检测将导致相应外显子产物缺失，即缺失外显子的信号全部消失，重复区表现出信号成倍增加。女性携带者，相应的外显子缺失信号将降低35%～55%，而重复突变时相应的信号将升高 30%～55%。

表1 DMD 基因单个外显子的扩增引物信息Table1 Primers information of DMD gene single exon

1.2.3 基因测序检测 对 MLPA 技术检测到DMD 基因存在单个外显子缺失的样品，采用 PCR技术、基因测序技术验证。

1.2.3.1 PCR 反应 根据 GenBank 上 DMD基因序列 NC_000023.9，用 Primer premier 5.0 软件设计引物，扩增 DMD 基因单个外显子的基因序列。引物由上海英骏生物技术公司合成，序列如表1。

PCR 反应总容积为10 µl，每一反应体系中含10×PCR Buffer II 1.0 µl，3.2 µmol/L 上下游引物各 1.0 µl、10 mmol/L的dNTP 混合物 0.35 µl，5.6 units/µl的ActiTaq DNA Polymerase 0.07 µl，模板 DNA 1.0 µl。反应条件为94 ℃ 12 min（94 ℃30 s，52 ℃ 或 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）35个循环；72 ℃ 延伸 10 min；4 ℃ 保存。扩增完成后取5.0 µl PCR 产物，DNA Marker 标记，于2.0% 琼脂糖凝胶，电压 120 V，电泳大约 30 min，BIO-RAD凝胶成像系统观察结果，若显示各上样孔扩增条带清晰，结果可靠，可用于基因测序检测。

1.2.3.2 基因测序检测 PCR 反应体积为10 μl，分别加入 1 μl的纯化 PCR 产物，1 μl Primer（3.2 pmol/μl），2 μl H2O，1 μl的5×Sequencing buffer和0.35 μl的BigDye Terminator v3.1。反应条件为：96 ℃ 1 min（96 ℃ 10 s，50 ℃ 5 s，60 ℃4 min）25个循环；25 ℃ 保存。对测序 PCR 反应产物进行纯化后，每个样本加 10 μl的Hi-Di（甲酰胺），94 ℃ 加热 4 min 后放置冰上 5 min，在ABI genetic analyzer 3130xl 上进行毛细管电泳。电泳结束后使用 Sequencing Analysis 5.2和Mutation Surveyor 软件进行结果分析。

2 结果

2.1 MLPA 技术检测结果

在185 例样本中，MLPA结果显示 7 例为DMD 基因单个外显子缺失，其信息见表2。以其中家系 2的697号样本为例，其 MLPA 毛细管电泳结果及软件分析结果如图 1和2 所示。

2.2 PCR 及基因测序结果

2.2.1 PCR结果 根据表 2的MLPA 检测结果，PCR 验证 DMD 基因外显子是否发生缺失。其中家系 1、3、4、5、6、7结果显示确为DMD 基因单个外显子缺失，结果以家系 1的PCR 电泳图（图 3）为代表。其中家系 2结果显示无 DMD 基因单个外显子缺失（图 4），需要通过基因测序验证。

表2 样本基本信息及MLPA、PCR 基因测序结果Table2 Basic information of the samples and results of MLPA, PCR and gene sequencing

图1 MLPA 显示 697号样本“67 外显子缺失”Figure1 MLPA result shows the 697 sample of “67 exon deletion”

2.2.2 基因测序结果 对家系 2 中的697号样本进行基因测序分析（图 5和6），发现其存在一处插入突变（c.9760_9781dupTTTGGGGGCAGTAA CATTGAGC），引起框移突变（p.Pro3261LeufsX5）。

3 讨论

DMD 基因突变的形式多样，其中缺失突变占 55%～65%，重复突变占 5%～10%，其他微小突变约占 25%～30%[4]。目前，国内常用的检测 DMD 基因缺失/重复突变的技术有：southern blot、多重 PCR 技术、MLPA 技术、变性高效液相色谱技术（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）、DNA 微阵列技术等[5]。由于southern blot 杂交法耗时、工作量大，迅速被多重 PCR 法替换，后者能检测到覆盖 DMD 基因18个外显子所发生的突变，能检测到 DMD 基因的缺失热区，但不能覆盖 DMD 基因的79个外显子，不能检测到杂合缺失，也不能检测重复突变。MLPA 技术是后来出现的一种比多重 PCR 法更为先进的检测技术，能检测发生在所有 79个外显子的缺失/重复突变，同时也可检测杂合型缺失/重复突变[6-7]。检测 DMD 基因微小突变的技术有：依赖于使用 RNA的体外蛋白截短实验（protein truncation test，PTT）、编码序列直接测序法、使用基因组的变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、异源二聚体分析、变性高效液相色谱等方法[5]，这些方法各有优缺点，但比较适合实验室使用的是直接测序法。联合使用 MLPA 技术和基因测序技术，可以检测到绝大多数 DMD 基因突变。

图2 MLPA 软件分析显示 697号样本 67 外显子缺失Figure2 MLPA of the software analysis showed that 697 sample is the 67 exon deletion

图3 家系 1的PCR 电泳图Figure3 The electrophoresis result of family 1

图4 家系 2的PCR 电泳图Figure4 The electrophoresis result of family 2

图5 697号样本 DMD 基因 67号外显子的测序结果Figure5 The 67 exon sequencing result of 697 sample

图6 697号样本 DMD 基因 67号外显子突变序列与探针连接序列Figure6 The repeat sequence and probe ligation sequence of DMD gene exon 67

MLPA 技术在DMD 检测中的应用主要针对大片段的缺失和重复突变。通常，DMD 基因缺失突变涉及多个相邻的外显子，少数可表现出单个外显子的“缺失”。实际上，MLPA 检测到的DMD 基因单个外显子缺失可分成两种情形：①真正的缺失突变；②探针结合区的微小突变。

当使用 MLPA 技术检测到 DMD 基因存在单个外显子缺失时，本实验室用 PCR 技术、基因测序技术来验证，以提高检测单个外显子缺失的准确率，避免将单个外显子的微小突变误判为缺失突变。本文家系 2 中的697号样本，微小的插入突变（c.9760_9781dupTTTGGGGGCAGTAACATTGA GC）刚好发生在探针连接点（AGTAACATTG-A GCCAAGTGT）上[2]（图 6），从而影响了探针与模板的结合，导致最后67号外显子对应的产物大大降低，造成 67号外显子缺失的假阳性结果[8]。通过 PCR 技术、基因测序技术，证实其是 67号外显子的微小突变。

[1]Zhang C.Duchenne/becker muscular dystrophy//Lu GH, Xu XM.Clinical genetic counseling.Beijing: Peking University Medical Press.2007:272-275.(in Chinese)张成.假肥大型肌营养不良症//陆国辉, 徐湘民.临床遗传咨询.北京: 北京大学医学出版社, 2007:272-275.

[2]SALSA MLPA kit P034 DMD mix 1.Holland: 2000 (2010-05-24)[2011-8-24].http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=tz2fAPIAupKyMjaDFE 9bmuxqlhe/Lgqfk8Hkjuss|&Prod uctOID=KlBSAzXA8pg|.

[3]SALSA MLPA kit P035 DMD mix 2.Holland: 2000 (2010-05-24)[2011-8-24].http://www.mlpa.com/WebForms/WebFormProductDetails.aspx?Tag=tz2fAPIAupKyMjaDFE 9bmuxqlhe/Lgqfk8Hkjuss|&Prod uctOID=CwGDaIKqVKc|.

[4]Darras BT, Korf BR, Urion DK.Dystrophinopathies.Seattle (WA):University of Washington, Seattle.1993 (2008-3-21) [2011-8-24].http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=203.01298

[5]Shen BC.The analysis of Duchenne muscular dystrophy patients and carriers of the gene deletion, duplication and point mutation.Guangzhou: Sun Yat-sen University, 2006.(in Chinese)申本昌.Duchenne型肌营养不良症患者及携带者的基因缺失、重复和点突变分析.广州: 中山大学博士后出站报告, 2006.

[6]Zhou DW, Ren ZR.Multiple ligation-dependent probe amplification and its application.Chin J Med Genet, 2009, 26(1):45-49.(in Chinese)周大文，任兆瑞.多重连接探针扩增技术及其应用.中华医学遗传学杂志, 2009, 26(1):45-49.

[7]Hu X, Li W, Lu GX.Advancement in the application of multiplex ligation-dependent probe amplification.Prog Mod Biomed, 2010,10(2):362-365, 294.(in Chinese)胡晓, 李汶, 卢光琇.多重连接依赖性探针扩增技术及其应用进展.现代生物医学进展, 2010, 10(2):362-365, 294.

[8]Wang Q, Li-Ling J, Lin C, et al.Characteristics of dystrophin gene mutations among Chinese patients as revealed by multiplex ligation-dependent probe amplification.Genet Test Mol Biomarker,2009, 13(1):23-30.