郇英，佳那提·秋瓦西，张隽，刘敏，吕涌涛，陈兴旺，郭明辉，罗朝霞，郑洁静，胡祥，叶圣勤，姜舒

儿童孤独症（autism）属于自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）中的一种，起病于婴幼儿期，是一种广泛性发育障碍，主要表现为语言交流障碍、社会交往障碍和古怪、刻板行为。美国儿童自闭症谱系障碍发病率约为1/110，其中男女患病率分别为1/70和1/315[1]。儿童孤独症的发病原因尚不明确，近年研究表明可能与基因、生物、环境以及其他疾病等多种因素有关。对于孤独症儿童患者的治疗，目前临床应用行为干预、特殊教育训练、家庭治疗计划为主，辅以药物疗法，虽然取得了一定疗效，但尚未达到理想的效果[2]。生物技术领域取得的成果吸引了越来越多的研究者和临床医生，其中干细胞治疗的研究为儿童孤独症治疗提供了新的思路。血流灌注不足造成大脑缺氧及免疫功能异常是孤独症的重要病理学基础，而干细胞可以改善病变局部的血流灌注并可以调节异常的免疫功能，我们应用脐血单核细胞（cord blood mononuclear cells，CBMNCs）及脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）联合康复训练治疗儿童孤独症，取得较好疗效。

1 对象和方法

1.1 研究对象

1.1.1 选择标准

⑴入选标准：所有研究对象年龄在3～12 岁，性别不限；由精神科专科医师诊断符合 DSM-IV儿童孤独症诊断标准，儿童孤独症评定量表（childhood autism rating scale，CARS）评分 ≥30 分，且父母或其法定监护人同意并签署《知情同意书》。

⑵排除标准：主要包括对血清制品过敏或敏感体质，精神障碍患者，Asperger 综合征，Rett 综合征或未分类的帕金森病痴呆（PDD）患者，近 6个月内有癫痫发作史者，因活动性癫痫、脑血管疾病或脑外伤等原因造成的孤独症患者，中度或重度锥体外系症状或迟发性运动障碍者，具有明显自伤行为以及合并其他严重疾病的患者。

1.1.2 对象分组 选取 2009年3 月–2009年9 月在山东省交通医院住院行干细胞治疗的儿童孤独症患者 23 例，分为脐血组和混合组，分别为14 与9 例，其中脐血组男 13 例，女 1 例，年龄跨度 3.29～12.02 岁，平均年龄（7.41±2.63）岁；混合组男 9 例，女 0 例，年龄跨度 3.98～9.83 岁，平均年龄（6.20±2.12）岁。另选取在济南明天儿童康复中心行康复训练治疗的儿童孤独症患者 14 例（脱落 1 例）为对照组，其中男14 例，女 0 例，年龄跨度 3.51～10.02 岁，平均年龄（5.60±2.01）岁。三组受试者在年龄、性别组成、身高、体重、病情轻重程度以及家族遗传史及母孕情况上差异均无统计学意义，具有可比性。

1.2 干细胞来源

研究细胞由北科生物细胞工程研究所提供。干细胞来自健康分娩孕妇的脐血和脐带（产妇知情同意），均经过抗 HIV、梅毒抗体及肝炎标志物 5 项、Torch 5 项等检测，经过分离、提取、培养、扩增，并传至第 4～6 代。

1.3 方法

本研究采用非随机、开放、对照、单中心 I 期临床试验设计，分为对照组（康复训练治疗）、脐血组（CBMNCs + 康复训练治疗）、混合组（CBMNCs 联合 UCMSCs + 康复训练治疗）。其中脐血组：第 1 次治疗采用 CBMNCs 静脉途径治疗、后3 次采用 CBMNCs 腰椎穿刺蛛网膜下腔途径治疗；混合组：第 1 次采用 CBMNCs 静脉途径治疗、第 2 次采用 CBMNCs 腰椎穿刺蛛网膜下腔途径治疗，后2 次均采用 UCMSCs 腰椎穿刺蛛网膜下腔途径治疗；三组患者均由济南明天儿童康复中心专业康复师行感觉统合及行为康复训练治疗。干细胞治疗共 4 次，每周 1 次，每次治疗细胞数量为2×106/kg，共观察 24周。试验开始前获山东省交通医院伦理委员会审核批准，并根据国务院《医疗机构管理条例》的规定[3]获得受试者监护人的知情同意。

1.4 评价指标

3组受试者行干细胞治疗和康复训练治疗前和首次治疗后2、4、8、16、24周分别进行 CARS、ABC 评估[4]。ABC 量表评估包括 58个小分项，分为易激惹、嗜睡、刻板行为、兴奋性及不恰当语言 5个大分项，采用 0～3 分评分标准，分别代表不构成任何问题、只构成小问题、问题比较严重、问题非常严重。量表评估由山东省精神卫生中心作为第三方完成。

1.5 统计学分析

定量数据采用例数、均数、标准差描述，定性数据采用频数、构成比或百分比描述。用 SPSS13.0统计软件包进行统计分析，定量数据 3组间比较及治疗前后比较分别采用多元方差分析以及重复测量方差分析，组间比较方差不齐时，采用Tambane’s T2 法分析，采用 Pearson 相关分析其ABC 与CARS 两者相关性，以 P＜0.05 为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 ABC 各因子分析

由表1 可知，ABC 评分中嗜睡、刻板行为、兴奋性及不恰当语言因子，24周时脐血组下降百分比分别为21.4%、42.0%、42.2%、62.5%。混合组下降百分比分别为48.4%、67.1%、60.7%、54.0%。对照组嗜睡、刻板行为及兴奋因子下降百分比分别为12.9%、24.0%、16.4%，而不恰当语言因子，则由基线的（2.38±2.10）波动至（2.46±2.63），轻微上升 3.4%。

三组在24周随访点，ABC 嗜睡与刻板行为因子评分差异具有统计学意义（F=9.21，P＜0.05与F=3.93，P＜0.05），两两比较可知，混合组分别与脐血组、对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05）。干细胞治疗组与对照组间 ABC 兴奋及不恰当语言因子在基线时评分差异具有统计学意义（F=5.99，P＜0.05 与F=4.09，P＜0.05），对照组明显低于干细胞治疗组，但在24周随访点三组间差异不具有统计学意义（F=1.02，P ＞0.05 与F=0.098，P ＞0.05）。易激惹因子评分三组在不同随访时间点的比较中，差异均无统计学意义（P ＞0.05）。

随访时间点各组组内比较，脐血组刻板行为因子基线评分与4、8、16、24周时比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；混合组嗜睡及刻板行为因子评分 24周时与基线的比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组嗜睡因子评分24周时与基线的比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 三组资料 ABC 评分分项比较分析结果Table1 ABC subscale score of 3 groups

表2 三组资料 ABC 评分比较分析结果Table2 ABC score of 3 groups

2.2 ABC 总分分析及与CARS 评分相关性

2.2.1 ABC 总分分析 由表 2 可知，脐血组、混合组与对照组ABC 评分在随访时间内均有一定程度的下降，24周时下降百分比分别为38.0%、59.9%、17.4%，不同随访时间点的三组比较，其中 24周时三组的ABC 评分差异具有统计学意义（F=3.73，P＜0.05），两两比较可知，混合组分别与脐血组、对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），提示在24周时混合组ABC 评分明显低于脐血组与对照组。三组ABC 评分各随访时间点与基线比较：混合组与对照组24周时与基线的比较、脐血组8、16、24周时与基线比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.2.2 ABC 总评分与CARS 总评分相关性分析 由表 3 可知，ABC 总评分与CARS 总评分呈正相关，且随访视时间点的延长，相关系数 r 由基线时的0.61 逐渐增加至 6个月时的0.87（P＜0.001），提示 ABC 与CARS 评估结果比较在干细胞治疗前后的各个时间点具有密切相关性，因此量表 ABC 具有较高的效度。

表3 ABC 总评分与CARS 总评分相关性分析Table3 Correlation of ABC score and CARS score

3 讨论

儿童孤独症属于自闭症谱系障碍的一个亚类，其病因尚未明确，但在病理改变上与中枢神经系统的组织血流灌流不足、脑组织形态学的改变以及免疫异常等密切相关。既往研究结果显示，中枢神经血流灌流不足及其导致的组织缺血缺氧的程度与孤独症症状的严重程度密切相关。血流灌注不足导致的脑组织缺氧，不仅造成神经元细胞的凋亡和坏死，还可导致异常脑组织代谢和神经递质的蓄积[4]。此外，孤独症患儿体内常存在星形胶质细胞、T 细胞、B 细胞等多种免疫细胞功能异常[5]。

目前尚无针对血流灌注不足及免疫功能异常病理基础的有效药物治疗，而生物治疗，尤其是干细胞治疗有望成为改善孤独症临床症状的有效手段之一。CBMNCs 含有许多未成熟干细胞，如CD34+ 细胞，具有很强的增殖、自我更新能力及多向分化潜能：体外适当条件下培养诱导后可表达神经干细胞及血管内皮祖细胞标记物；植入发育中的大鼠脑内可分化成神经元或神经胶质细胞，且能够分泌多种生长因子及神经营养因子；CBMNCs侧脑室移植可改善远期行为学，对缺氧缺血性脑损伤治疗有效，对新生动物损伤的脑组织有神经保护作用。有临床研究表明，CBMNCs能有效改善血管性痴呆患者认知功能和日常生活能力，延缓和阻止病情发展，有助于神经功能的恢复，提高患者的生活质量。CD34+ 细胞在终末期心肌缺血及外周动脉疾病中用于诱导血管生成的治疗已取得一定成果[6-9]。UCMSCs 可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经细胞等多种成体细胞。MSCs能够持续分泌白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子，可产生前列腺素-2（prostaglandin E-2，PGE-2）、色氨酸分解代谢酶吲哚胺 2，3-双氧化酶（tryptophan catabolizing enzyme indoleamine 2, 3-dioxygenase）和半乳凝集素-1（galectin-1）等多种免疫调节因子，并可以通过抑制树突状细胞的成熟与抗原提呈能力达到非特异性调节免疫应答的作用。另有调查发现，30%～75% 患儿存在神经系统发育不完善或发育异常，前额叶的不正常发育可能解释孤独症的强迫性行为。MNCs 与UCMSCs 表达的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）、睫状神经营养因子（giliary neurotrophic factor，GNTF）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）等因子有利于促进神经元的再生；它们还可以向神经细胞方向分化，表达神经细胞的相关标记物，有望替代和修复受损组织，改善并提高神经系统功能[10-12]。

本研究应用 CBMNCs 以及CBMNCs 联合UCMSCs结合康复训练治疗儿童孤独症，采用ABC 量表对治疗效果进行评估，结果提示干细胞联合康复训练治疗疗效明显优于单纯康复训练对照组，其中混合组治疗效果最优，脐血组疗效次之。对 ABC 评分各分项进行分析，除了易激惹分项在不同随访时间点的三组比较中无差异外，嗜睡、刻板行为因子评分，三组治疗方式都有一定程度的改善，其中混合组的疗效最好；对兴奋因子及不恰当语言因子评分，干细胞治疗组与对照组在基线时ABC 兴奋评分存在很大差异，但随着治疗进展，最终 24周随访，三组兴奋及不恰当语言因子评分到达同一个水平。对照组24周时，嗜睡因子改善明显，而脐血组和混合组24周时，不仅嗜睡因子改善明显，且刻板行为因子改善亦有统计学差异，说明干细胞治疗在刻板行为因子改善方面明显优于传统康复训练。分析干细胞治疗发挥作用可能是由于改变了这些改善症状相应在神经系统定位部位（岛叶、杏仁核、颞叶、前额叶、尾状核和小脑等）的递质分泌或者改善了病变部位的血液循环而促进了机体神经功能的恢复。

目前在我国多采用 CARS 及孤独症行为量表（autism behavior checklist）作为评价儿童孤独症病情的工具，但这些量表难以充分反映儿童孤独症临床症状变化，尚缺乏高效、实用、适合普及的孤独症筛查量表。国内外多项研究证实，ABC 量表适于儿童孤独症的临床量化评估[13-16]，国内学者马俊红等[17]最新研究发现，ABC 中文版具有较好评定者信度及重测信度，该量表各因子内部一致性信度相当好；ABC 中文版各因子与CARS、孤独症行为评定量表、Conner 父母评定量表及Achenbach儿童行为量表的相应因子间呈正相关（r 在0.27到 0.67 之间，均 P＜0.01）；并验证性因素分析检验了结构的有效性。本项研究亦发现，ABC 与CARS的评估结果在干细胞治疗前后的各个时间点均具有密切相关性，两者相关系数由基线时的0.60逐渐升至 24周时的0.87（P＜0.001），在评价儿童孤独症疗效时具有较高的效价。综合以上研究可以得出结论：量表 ABC 具有较高的效度，可以作为诊断与评定儿童孤独症的有力工具之一。ABC与CARS 可以从不同的角度对孤独症的病情进行评估，我们认为与CARS 量表相比，ABC 量表各个分项更加具体，在临床应用中具有更高的敏感性和可操作性，且操作简便，具有更高的临床应用推广价值。

本研究结果提示，联合应用 CBMNCs和UCMSCs结合康复训练治疗儿童孤独症的疗效显著高于传统的康复训练治疗，且 ABC 量表对评估儿童孤独症具有较高的效度。鉴于纳入本次研究的病例数相对较少，随访时间较短，对远期疗效未进行观察评估，以及对干细胞发挥疗效的确切机制尚未明确，该研究尚需开展随机、双盲、对照、多中心的临床试验进一步探讨及深入。

[1]Mitka M.Rising autism rates still pose a mystery.JAMA, 2010,303(7):602.

[2]Guo LT, Shan YH.Progress in clinical studies of autism.Chin Ment Health J, 1997, 11(3):165-167.(in Chinese)郭兰婷, 单友荷.孤独症的临床学研究进展.中国心理卫生杂志,1997, 11(3):165-167.

[3]The State Council of the People's Republic of China.Administrative Regulations on Medical Institution.1994-09-01.(in Chinese)中华人民共和国国务院.医疗机构管理条例.1994-09-01.

[4]Critchley HD, Daly EM, Bullmore ET, et al.The functional neuroanatomy of social behavior: changes in cerebral blood flow when people with autistic disorder process facial expressions.Brain,2000, 123(Pt11):2203-2212.

[5]Cohly HH, Panja A.Immunological findings in autism.Int Rev Neurobiol, 2005, 71:317-341.

[6]Gluckman E, Broxmeyer HA, Auerbach AD, et al.Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from a HLA-identical sibling.N Engl J Med,1989, 321(17):1174-1178.

[7]Hu MY, Deng JW, Wang XL.Improvement of histology adn long-term ethology of hypoxic iscIilemic brain damage neonatal rats after umbilical cord mononuclear cell transplantation.J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2008, 12 (34):6648-6652.(in Chinese)胡明英, 邓进巍, 王晓莉.脐血单个核细胞移植后缺氧缺血性脑损伤新生鼠组织学及远期行为学的改善.中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(34):6648-6652.

[8]Man Y, Li JB, Ma J, et al.Human umbilical cord blood-mononuclear cell vein transplantation for treating vascular dementia in 18 elderly patients.J Clin Rehabil Tissue Eng Res, 2008, 12(47):9359-9362.(in Chinese)满勇, 李建斌, 马冀,等.多份人脐血单个核细胞静脉移植治疗老年期血管性痴呆 18例.中国组织工程研究与临床康复, 2008,12(47):9359-9362.

[9]Vaziri H, Dragowska W, Allospp RC, et al.Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age.Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(21):9857-9860.

[10]Kadri T, Lataillade JJ, Doucet C, et al.Proteomic study of Galectin-1 expression in human mesenchymal stem cells.Stem Cells, 2005,14(2):204-212.

[11]Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, et al.Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection.J Inflamm (Lond), 2005, 2:8.

[12]Liu J, Lu XF, Wan L, et al.Suppression of human peripheral blood lymphocyte proliferation by immortalized mesenchymal stem cells derived from bone marrow of Banna Minipig inbred-line.Transplant Proc, 2004, 36(10):3272-3275.

[13]Wang ZC, Qian DM, Sheng XW, et al.Analysis on the childhood autism with the autistic behavior check list(ABC).J Clin Pediatr, 2002,20(2): 80-81.(in Chinese)王子才, 钱冬梅, 盛晓尉,等.用ABC量表分析儿童孤独症.临床儿科杂志, 2002, 20(2):80-81.

[14]Li JH, Zhong JM, Cai LY, et al.Childhood autism rating scale clinical study.Chin J Child Health Care, 2005, 13(3):267-268.(in Chinese)李建华, 钟建民, 蔡兰云,等.儿童期孤独症评估量表的临床应用研究.中国儿童保健杂志, 2005, 13(3):267-268.

[15]Lu JP, Yang ZW, Shu MY, et al.Reliability, validity analysis of the childhood autism rating scale.China J Mod Med, 2004, 14(13):119-121, 123.(in Chinese)卢建平, 杨志伟, 舒明耀,等.儿童孤独症量表评定的信度、效度分析.中国现代医学杂志, 2004, 14(13):119-121, 123.

[16]Rojahn J, Helsel WJ.The Aberrant Behavior Checklist with children and adolescents with dual diagnosis.J Autism Dev Disord, 1991,21(1):17-28.

[17]Ma JH, Guo YQ, Jia MX, et al.Reliability and validity of the Chinese version of the Aberrant Behavior Checklist(ABC)in children with autism.Chin Ment Health J, 2011, 25(1):14-19.(in Chinese)马俊红, 郭延庆, 贾美香,等.异常行为量表中文版在儿童孤独症群体中的信效度.中国心理卫生杂志, 2011, 25(1):14-19.