储 毅 刘全华 华 丽 朱亚菊 高苗苗 鲍一笑

(上海交通大学医学院附属新华医院儿童呼吸科,上海200092)

人白介素13(hIL-13)是主要由Th2细胞分泌的细胞因子,在变态反应性疾病特别是儿童哮喘的发病过程中具有核心介质的作用[1]。IL-13 A2044G是位于人IL-13基因第四号外显子的单核苷酸多态性位点,即2044位碱基发生G到A突变,导致相应蛋白质多肽链第130位氨基酸由精氨酸(Arg,R)转变为谷氨酰胺(Gln,Q)。本实验室前期研究发现IL-13 A2044G在儿童哮喘组与正常对照组间的差异有显著的统计学意义,为儿童哮喘发病的易感多态性位点[2]。为了利用哺乳细胞表达人 IL-13及其突变体,更进一步地研究该多态性位点在功能方面对哮喘发病的影响,本实验室分别构建了含有野生型IL-13和突变型IL-13基因的哺乳细胞表达质粒。

1 材料与方法

1.1 质粒、载体、菌株、工具酶和试剂 质粒pET28a-hIL-13(包含有人IL-13信号肽编码序列和成熟IL-13编码序列)为本实验室构建;Fetal brain cDNA,购于美国Stratagene公司;PfuI酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Angel DNA polymerase,购于美国 GenScript公司,内含 10×Angel buffer和MgCl2(25 mmol/L);pcDNA3.1(+),购自美国Invitrogen公司;凝胶回收试剂盒购自上海捷倍思基因技术有限公司;限制性内切酶HindⅢ(10 U/μl)、EcoR Ⅰ(10 U/μl)及 T4 DNA 连接酶(100 U/μl)购自 MBI Fermentas公司;碱性磷酸酶CIAP(20 U/μl)购自宝生生物工程(大连)有限公司;质粒扩增菌株E.coli DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司;主要试剂为国产或进口分析纯。

1.2 hGH-hIL-13融合蛋白序列的设计 融合蛋白氨基酸序列如下:

①蓝色字体为人生长激素蛋白序列(包含信号肽部分);②加阴影字体为人成熟IL-13的蛋白序列(不包含信号肽部分);③中间红色加下划线字体为TEV蛋白酶识别序列,此酶在识别序列的第6个氨基酸处(ENLYFQ↓G)切割蛋白。……