孙建新，王 忠，吕晓敏(新疆医科大学医学实验动物中心，乌鲁木齐830011)

[本文编辑] 兰 芬

糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱疾病，伴有因胰岛素分泌和作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常[1]。近年来，糖尿病发病率急剧增加，为了更深入地研究糖尿病的作用机制以及筛选、研发新药物，制备一个稳定可靠的动物模型至关重要。目前，制备糖尿病动物模型主要有4种方法，即化学物质诱导法、动物胰腺部分切除法、转基因法和遗传法。本研究采用四氧嘧啶(alloxan，ALX)诱导法制备2型糖尿病小鼠模型，考察了诱导过程中各因素对小鼠模型的血糖的影响，从而确定制备2型糖尿病小鼠模型的最佳方案。

1 材料和方法

1.1 材料 290只雄性昆明种小鼠，体重18～35g，由新疆医科大学医学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(新)2003－0001。Onetouch Ultra Easy稳豪型血糖仪和血糖试纸[强生(中国)医疗器材有限公司]；AL204型电子分析天平[梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司]；ALX(分析纯，美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 ALX剂量的影响实验 取120只体重为18～22g的小鼠，以随机数字表法分为正常对照组和A、B、C、D、E 5个模型组，每组各20只，放入水冲式饲养笼具中饲养。夜间禁食不禁水，12h后，按10ml／kg体重的剂量，正常对照组腹腔注射生理盐水；A、B、C、D、E模型组分别腹腔注射浓度为250、200、150、100、50mg／kg的ALX水溶液[2]。注射后48h内灌胃给予10%葡萄糖水溶液(灌胃容积为20ml／kg)，以防止小鼠因低血糖死亡[3]。自注射ALX后72h开始禁食12h，尾静脉取血，用血糖试纸测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，将FBG≥11.1mmol／L的小鼠作为造模成功，计算成模率与死亡率[4]。成模率(%)＝(造模成功的小鼠数／存活小鼠数)×100%，死亡率(%)＝(死亡小鼠数／20)×100%。

1.2.2 不同体重的影响实验 取体重为18～22.0g、22.1～28.0g、28.1～35.0g的小鼠各20只，分别作为低、中、高体重组。按1.2.1项下的方法，以150mg／kg的ALX诱导造模，测量FBG，计算成模率和死亡率[5]。

1.2.3 禁食时间的影响实验 选取体重为18～22g的小鼠50只，按1.2.1项下的饲养和造模方法，腹腔注射150mg／kg的ALX诱导造模。造模72h后以随机数字表法分成5组，各组小鼠于第4天22：00开始，分别禁食不禁水8、10、12、14、16h，测量FBG，计算平均值。测定FBG后，脱颈椎处死小鼠，解剖查看胃肠道排空情况。

1.2.4 垫料的影响实验 选取体重为18～22g的小鼠60只，以随机数字表法分为正常组和模型组各30只。按1.2.1项下的方法，模型组小鼠腹腔注射150mg／kg的ALX诱导造模。造模后72h，以随机数字表法将模型组小鼠分成A、B、C三组，正常组小鼠分成a、b、c三组，每组10只。其中A组和a组小鼠放入水冲式笼具(无垫料)中饲养，B组和b组小鼠放入更换新垫料的塑料笼具中饲养，C组和c组小鼠放入不更换垫料的塑料笼具中饲养。各组小鼠于第4天22：00开始，禁食不禁水12h后测量FBG。计算各组小鼠的FBG平均值，比较组间差异。

1.2.5 小鼠胰腺组织形态学检测 取1.2.1项下正常对照组和1.2.4项模型C组小鼠各10只，在检测FBG后，立即脱颈椎处死，解剖小鼠，取胰腺组织，以10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察小鼠胰腺组织的形态学改变。

1.2.6 模型小鼠FBG的变化规律 对1.2.4项下的小鼠，每周禁食不禁水12h，测量FBG，计算平均值，连续5周，观察小鼠的FBG变化情况。

1.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料以±s表示。多组间差异采用单因素方差分析，两样本均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ALX剂量对小鼠FBG的影响 5个不同剂量的ALX诱导糖尿病小鼠模型的成模率、死亡率和FBG见表1。由表1可见，随着给药量的增加，成模率逐渐升高，但小鼠的死亡率也随之升高。考虑需要对小鼠进行长期观察，权衡成模率和死亡率，建议ALX的给药量控制为100～150mg／kg。

表1 不同剂量的四氧嘧啶对糖尿病小鼠模型成模率、死亡率和空腹血糖的影响Table 1 Effects of different doses of alloxan on successful modelization rate，mortality and fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s)

表1 不同剂量的四氧嘧啶对糖尿病小鼠模型成模率、死亡率和空腹血糖的影响Table 1 Effects of different doses of alloxan on successful modelization rate，mortality and fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与正常对照组比较

组别 四氧嘧啶剂量(ρB／mg·kg－1)成模率(%)死亡率(%)空腹血糖(cB／mmol·L－1)正常对照组0 0 0 5.09±1.75模型组 250 100 30 32.11±3.52＊＊200 95 15 30.43±6.23＊＊150 90 5 25.57±5.56＊＊100 75 0 21.67±5.75＊50 40 0 11.88±6.54＊

2.2 小鼠体重对FBG的影响 高、中、低体重组分别有1、3、5只小鼠死亡，有12、17、19只小鼠造模成功，造模成功率分别为60%、85%和95%，FBG分别为(18.03±2.56)、(25.00±3.23)和(32.06±3.52)mmol／L(n＝20)。中、高体重组小鼠的FBG值与低体重组有显著性差异(P＜0.05)。小鼠出生后，随着生长发育，身体各项机能逐步完善，胰腺也逐步发育成熟，对药物的耐受性逐步增强。低体重组小鼠由于FBG值太高，糖尿病症状加重，在实验后期容易死亡。体重在22.1～28.0g的小鼠较适合用于制备2型糖尿病模型。

2.3 禁食时间对小鼠FBG的影响 不同禁食时间的小鼠的胃肠道排空情况和FBG测定结果见表2。由表2可见，小鼠禁食时间越长，胃肠道内残留的食物就越少，FBG值就不断降低，FBG最稳定的时间是在禁食后12～14h。

2.4 垫料对小鼠FBG的影响 正常组a、b、c组小鼠的FBG值分别为(5.23±1.75)、(5.86±2.45)和(7.24±5.85)mmol／L；模型组A、B、C 组小鼠的FBG值分别为(24.22±2.75)、(26.35±4.55)和(29.89±6.15)mmol／L。有垫料笼具中饲养的小鼠的FBG值比无垫料笼具中饲养的小鼠的FBG值要高许多(P＜0.01)，而且组内差异也很显著。考虑到实验结果的准确性，建议使用无垫料的水冲式笼具饲养糖尿病小鼠模型。

表2 禁食时间对糖尿病小鼠模型空腹血糖的影响Table 2 Effects of fasting time on fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝10，±s)

表2 禁食时间对糖尿病小鼠模型空腹血糖的影响Table 2 Effects of fasting time on fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝10，±s)

＊P＜0.05，与禁食16h比较

禁食时间(t／h)胃肠道排空情况平均空腹血糖(cB／mmol·L－1)8少量排空 25.82±6.36＊10 一半排空 24.61±5.22＊12 大部分排空 20.46±4.86＊14 基本排空 19.38±4.36＊16 全部排空14.20±5.46

2.5 小鼠胰腺组织形态的改变 正常对照组和模型C组小鼠的胰腺组织形态图见图1。由图1可见，与正常对照组相比，模型C组小鼠的胰腺组织结构散乱，胰岛细胞数目减少伴萎缩，部分B细胞胞浆内颗粒致密程度降低，呈现透亮。

图1 小鼠的胰腺组织形态图(HE染色，×400)Figure 1 Morphological photographs of pancreatic tissues of mice(HE staining，×400)

2.6 糖尿病小鼠模型的FBG的动态变化 连续5周监测对照组和模型组小鼠的FBG，发现模型组小鼠的FBG由第1周开始上升，第2周上升到最高值，第3周时下降到最低值，但仍＞11.1mmol／L。随后两周FBG不断回升，虽有较小波动，但相对稳定。在1～5周内模型组和正常对照组小鼠的FBG均有统计学差异(P＜0.01，P＜0.05)，见表3。

表3 糖尿病小鼠模型空腹血糖的动态变化Table 3 Dynamic changes of fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s，cB／mmol·L－1)

表3 糖尿病小鼠模型空腹血糖的动态变化Table 3 Dynamic changes of fasting blood glucose of diabetic mice models(n＝20，±s，cB／mmol·L－1)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，与同时间的正常对照组比较

组别 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周正常对照组1.20模型组 24.20±2.24＊＊5.70±1.25 5.60±1.26 5.90±1.27 5.90±1.24 5.60±26.70±1.74＊＊22.20±4.10＊23.00±4.42＊24.40±3.49＊

3 讨 论

用ALX建立2型糖尿病小鼠模型，是通过破坏胰岛B细胞，使细胞DNA受损，并激活二磷酸腺苷(ADP)核糖体合成酶的活性，使辅酶Ⅰ含量下降，最终导致胰岛素缺乏，从而达到升高血糖的效果，成功建立2型糖尿病模型。这是构建糖尿病小鼠模型较常用的方法。关于ALX给药量、动物的体重和性别、光照等因素对造模效果的影响，相关文献较多[6，7]，但对禁食时间、是否禁食、有无垫料等因素对造模的影响未见报道。糖尿病的临床症状主要为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。目前，对糖尿病小鼠模型主要采取在塑料笼具里垫木材刨花饲养的方法。由于小鼠尿多且尿中糖含量很高，禁食期间小鼠会啃食垫料及垫料里的碎饲料和尿液，并且小鼠对糖的代谢存在个体差异，因此有垫料的笼具中饲养的小鼠模型FBG值不稳定。本研究发现，是否有垫料对模型小鼠的FBG有显著性影响，把小鼠放在无垫料的水冲式笼具里禁食饲养，之后测量的FBG值相对比较稳定。由于小鼠天性昼伏夜动，其进食、饮水、戏耍多发生在夜间，因此本研究采取在晚上22：00开始禁食。当小鼠的肠道完全排空后，血糖浓度达到低值，并且比较稳定。

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