张 睿，陈国强，张敬友，朱 娜，蒋 原，姜 焱，唐泰山

（江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001）

1958年，人们就已在实验猕猴中发现猴痘病毒[1]。自1970年首次报导扎伊尔地区出现人的猴痘病例以后，非洲中西部雨林国家都有零星病例发生[2]，特别是1996年2月至1997年10月在刚果发生了有史以来的最大的一次疫情暴发，确诊病例达511人[3-4]，2003年5月美国威斯康星州报导有猴痘病例的发生[5-6]，至此猴痘引起了人们的高度关注。

猴痘是动物传播的一种以皮肤出疹为特征的热性病毒性疾病，通过直接密切接触，可由动物传染给人，并可在人与人之间传染，属人畜共患传染病。猴痘病毒检测方法有血清学方法，但猴痘病毒与痘病毒之间存在抗原交叉，特异性不够，不能准确检测猴痘病毒，此外还有病原分离方法，但检测周期太长，且猴痘病毒被分类为生物安全Ⅲ级生物因子，对实验室生物安全要求极高。因此，两种方法在实际应用中存在一定的局限性。利用PCR方法对猴痘病毒核酸进行检测，灵敏度高，快速仅需几小时即可得到结果，国外也已有相关报导[7-10]，但国内就此方面的报道还为数不多。本试验旨在建立更敏感和特异的猴痘病毒PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

猴痘阳性模板为人工合成的MPV（AF380138）F3L基因片段（48 048~48 509 bp），插入质粒pUC57，由南京生兴生物技术公司合成。小鼠出血热病毒、小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、鼠痘病毒、鼠仙台病毒、鼠肝炎病毒、鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒、脑脊髓炎病毒、多瘤病毒、细小病毒、猴疱疹病毒Ⅰ型、羊痘、鸡痘、鸽痘等灭活病毒，购自中国药品生物制品检定所动物标准化室。

Taq酶、dNTP Mixture、溴化乙锭（EB）、Marker DL-2000、琼脂糖等试剂均由Takara公司生产；PCR凝胶回收试剂盒、HincⅡ限制性内切酶购自大连Takara公司 。

1.2 引物设计

根据猴痘阳性模板的序列，利用primer 5.0软件设计引物，由上海生工公司合成。合成的引物用双蒸水稀释至10 pmol/μL，-20℃保存备用。扩增目的片段为301 bp，引物序列如下。

上游引物：5'TTCCGTCAATGTCTACACAGGCA 3'；

下游引物：5'TACAGTTCCGACGATACTCCTC C 3'。

1.3 DNA提取

取阴性对照灭活病毒200μL，加入400μL裂解液、600μL的酚/氯仿混合液混匀，4℃12 000 r/min离心3~5 min；取上清加入600μL的氯仿混匀，4℃12 000 r/min离心5 min；取上清；加入0.8倍体积的异丙醇混匀，4℃10 000 r/min离心10 min，尽量倾去上清液；加入70%乙醇洗涤，离心3~5 min，晾干后加入50μL TE溶解沉淀。

1.4 质粒浓度的测定

取4μL提取的质粒，加入96μL的蒸馏水对待测的样品进行稀释，以蒸馏水作为空白，在波长260 nm处调节紫外分光光度计的读数至零。加入质粒的稀释液，测定260 nm处的吸光值，记录OD260的值通过计算确定浓度dsDNA=50×OD260×稀释倍数（浓度单位为：mg/mL）。

1.5 PCR反应

采用 20μL 的反应体系：2μL 10×buffer、0.4μL的25 mmol/LMgCl2、0.2μLTaq DNA聚合酶、上下游引物各 0.4μL、0.4μL 2.5 mmol/L dNTP、模板 0.5μL，用双蒸水补至20μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min后；95℃1 min，51℃1 min，72℃1 min共 35个循环；最后72℃延伸10 min。取8μL扩增产物用1.5%琼脂糖电泳观察结果。

1.6 PCR产物鉴定及序列测定

根据设计的PCR扩增序列，利用premier 5.0软件进行酶切位点的分析，其中HincⅡ为单酶切位点，所以采用此酶进行酶切分析。预期酶切成179 bp和122 bp 2个DNA片段。并同时将PCR产物送大连宝生物工程公司测序并用DNAstar软件分析。

1.7 敏感性

取阳性模板质粒4μL并按上面的实验方法测出其质粒浓度为59.3 ng/μL，并将阳性模板作10倍系列稀释，按照上述的方法分别取各稀释度的阳性模板，进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测灵敏性。

1.8 特异性

按上述试验方法提取鸡痘等灭活病毒的DNA，在相同的条件下进行PCR扩增，鉴定其特异性。

2 结果

2.1 PCR扩增

经过对引物浓度、Mg2+浓度、退火温度和时间进行优化后，用所设计的引物进行PCR扩增，能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带（图1）。

2.2 PCR产物酶切鉴定结果

用HincⅡ进行酶切分析，得到与预期一致的179 bp和122 bp 2个DNA片段（图2）。

2.3 敏感性

将阳性模板作10倍系列稀释，分别取各稀释度的阳性模板，进行PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色检测灵敏性。结果表明PCR检测方法可检测的下限为0.3 pg（图3）。

2.4 特异性

分别提取鸡痘等灭活病毒的DNA，在相同条件下进行PCR扩增，发现除猴痘模拟阳性模板出现特异性扩增条带外，其它病毒均没有扩增条带（图4）。

2.5 PCR产物测序结果

PCR扩增产物的测序结果与GenBank的F3L片段基因核苷酸序列完全一致，同源性达到100%。

3 讨论

猴痘是一种以皮肤出疹为特征的病毒性疾病，虽然在我国至今尚无猴痘的报道，但未雨绸缪，做好技术储备，很有必要。因此在我国发展一种快速特异的猴痘病毒感染的分子诊断方法，对预防和控制猴痘病毒的传入有重要意义。限于我国尚无猴痘病毒的毒种，本实验参照文献[11-12]人工合成了含特异检测猴痘病毒靶基因的F3L片段，并插入质粒，作为猴痘病毒检测的模拟阳性模板。

本文就针对F3L片段序列分别设计出特异性引物，建立了可对猴痘病毒进行快速诊断与检测的PCR方法。该方法具有快速、敏感的优点，测序结果和酶切结果均证实了PCR反应的特异性。在日常检测中的应用酶切试验，可确保PCR检测结果的特异性。该方法的建立将有助于猴痘病的快速检测。

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