桂东黄菌的科学名称辨识兼及庆元黄靛的正名

2011-11-16谭著明申爱荣傅绍春刘小娟唐树文

湖南林业科技 2011年2期

谭著明，申爱荣，傅绍春，刘小娟，唐树文

(1.湖南省林业科学院菌根性食用菌研究开发中心, 湖南长沙 410004； 2.上海市农业科学院食用菌研究所, 上海 201106;3.桂东县科技局, 湖南桂东 423500； 4.桂东县林业局,湖南桂东 423500)

谭著明1，申爱荣1，傅绍春2，刘小娟3，唐树文4

用形态分类和ITS序列分析法对湖南桂东黄菌进行了鉴定，用基于Bayians理论和Markov chain Monte Carl ( MCMC)算法的MrBayes3.1.2软件，将桂东黄菌与Genbank中牛肝菌科40个物种85个ITS序列进行系统发育树分析。结果表明，以欧洲缘盖牛肝菌(Boletusappendiculatus) ITS序列为外群，湖南桂东黄菌与来自浙江庆元的所谓“缘盖牛肝菌”的两个序列以97%的后概率聚为一支，并与云南小美牛肝菌(Boletusspeciosus)之ITS序列以79%的后概率聚为一支，而与欧洲缘盖牛肝菌ITS序列相比，谱系关系相距较远。认为，桂东黄菌的科学名称应为小美牛肝菌,庆元所产原名为缘盖牛肝菌的种类也应更正为小美牛肝菌。用MrBayes软件进行ITS序列分析的方法，对于在缺乏模式标本的情况下，难以准确识别的大型菌物种类的鉴定不失为一种可资借鉴的有效方法。鉴于小美牛肝菌较高的食用价值和强劲的市场需求，有必要加强栽培、促产等方面的研究。

小美牛肝菌；缘盖牛肝菌；ITS序列；谱系树; MrBayes

黄菌是湖南省桂东县对当地所产的一种商品价值较高的牛肝菌的俗称。黄菌主要分布于桂东县增口乡、寨前乡、黄洞乡、新坊乡、大塘乡、东洛乡、普乐乡、三洞乡、寒口乡、城关镇及与桂东毗邻的炎陵县平乐乡、江西省遂川县高坪镇、上犹县五指峰乡个别地段海拔780～900m的马尾松林中。是一种与马尾松等树种共生的菌根性食用菌。其营养丰富、味道鲜美，深受消费者喜爱。其干品经精细包装后作为特产馈赠远方亲友，是当地重要的地方名产。黄菌的分离培养比较困难，尤其是使其形成子实体更为不易。目前，市场供应全赖野外采集，由于市场紧缺，鲜品平均价格长年维持在70～80元/kg之间，最高达140元/kg，干品平均价约280～360元/kg。因货俏价高，过度采摘，自然资源受到一定程度的破坏，产量呈逐年下降之势。为使这一宝贵资源可持续地利用，从多领域开展对这一经济真菌的综合研究，特别是实现其人工栽培，或通过其它技术手段提高现有产菇林分中黄菌的产量乃是必然选择。

桂东黄菌虽然在当地高档农产品贸易中声名显赫，但从来没有人对其名称做过专门考证。类似的情况也曾存在于浙江庆元黄靛牛肝菌[1]。缺乏分类学意义上的科学名称，是其研究者开展学术交流，产业界人士实施产品标准化和市场开拓等商务开发中存在的一个障碍。

为此，本文采用形态学和分子生物学方法对桂东黄菌进行探究，以图确定其科学名称。

1 材料与方法

1.1试样采集

用于形态鉴定和菌种分离的黄菌新鲜子实体样品采自桂东寨前乡境内、桂东县林科所管辖的马尾松林内，地理位置为东经113°55.369′,北纬26°02.012′,海拔808m 。采集地为花岗岩发育的砂壤，坡度32°，坡向为东南，马尾松平均年龄为24年。密度1350株/hm2。同一处共采集到若干子实体，取其中无虫眼和损伤、发育正常的中等大小的子实体样品，分别用于分离培养、形态描述。

1.2黄菌的分离及鉴定

黄菌分离：采用组织分离法对黄菌新鲜子实体进行分离。培养基A(PDA)：马铃薯200g加1000mL纯水煮汁过滤，滤液中加葡糖糖20g，加水定容至1000mL；培养基B：NaCl 0.025g，CaCl20.25g，MgSO4·7H2O 0.15g，KH2PO40.5g，(NH4)2HPO40.25g，Ca(OH)20.5g，VB1100μg，葡萄糖8g，酵母膏3g，柠檬酸0.1g，1%柠檬酸亚铁溶液0.7mL，加水定容至1 000 mL。然后将培养基A和B按照体积比1∶2 混合，固体培养基再加入琼脂18～20g/L，分装，121℃灭菌20min备用。

黄菌DNA的提取：采用氯化苄法(朱衡等 1993)，适当改良。操作步骤如下：

(1) 取液体培养7d的黄菌菌液1.2mL于1.5mL离心管中，4000rpm离心5min，弃上清，用1mL TE缓冲液洗涤2次，再加入400μL DNA提取液，混匀。

2) 再加入50 μL 10%SDS、150μL氯化苄，剧烈振荡，使管内混合物呈乳状。在50℃保温1～2h，每隔10min振荡混合一次，直至溶液变粘稠。

(3) 加入50μL 3M NaAc混匀，冰浴15min，6 000rpm 4℃离心15min，取上清。

(4) 加入等体积异丙醇, 室温沉淀20min，10000rpm 4℃离心15min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗2次，阴干后溶于50μL TE缓冲液。

(5) 提取的DNA在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳检测。

用ITS1和ITS4作引物，提取的黄菌DNA做模板，扩增ITS片断。正反向引物序列分别为：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC。上述引物由上海生工合成。

反应体系如下：反应总体积25μL，其中Taq酶1μL，正向引物0.25μLmol，反向引物0.25μl mol，DNA模板50ng。

反应程序如下：95℃ 4min预变性；以下为循环反应过程参数：94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸60s，此循环连续反应40次；72℃延伸4min；反应产物在4℃下保存。所得PCR产物交由南京金思特公司测序。

用BioEdit 5.0.9[2]、 Clustalx 1.8分别将ITS相关序列进行序列整理、比对。用MrBayes 3.1.2软件分析，并绘出谱系图(系统发育树)。

2 结果与分析

2.1黄菌的形态特征

菌盖8～15cm，半球形至凸，后变宽凸，边沿反卷至平坦，偶有麻点和大而不规则形凹陷；表面干，无光泽，边缘向内弯曲，全体亮红至玫瑰粉红，或最终变暗而成葡萄酒色或更亮，受伤变蓝。肉厚，10～15mm，实，切开处组织苍白黄色，很快变蓝；新鲜时有稍浓郁之菌香味；遇KOH显橙色，遇FeSO4显灰色。菌管9～15mm长，并生或下陷，菌柄上有下延线或网状组织，稍老时，菌柄常由亮黄色变为蜜黄色。菌柄长5～13cm，顶部1.5～4cm厚,基部棍棒状至窄截形,实, 肉黄,至顶部苍白,上部色淡黄，受伤很快变蓝,基部常为铬黄色。孢子印橄榄褐色,孢子11～15×3～4μm,光滑, 正面观窄椭圆形至拟纺缍形，末端稍尖。此形态特征与Smith 及Thiers 对小美牛肝菌(Boletusspeciosus)标本的描述基本一致[3]。

2.2黄菌ITS序列分析及与牛肝菌科其它种类的关系

经对测序结果与ITS首尾起止位置进行精确比对，去掉冗长多余碱基，得到黄菌ITS序列如下：

GAGGGGGGGGAGATGGAGGAGTGAAGACTGTCGCTGGCCCCATCTCTGGGTGGAGCATGTGCACGTCTTCCTTTTCGTCGACCCCCTTTCTCACACACAACACACACCTGTGCACCTGTTGTAGGTCCTCGGAAGAGGATCTATGTTTTTCACATCACACACCATCATATGTCTATAGAATGTATTGAAGACCGTCCGGGATG(ITS1)GATGGTCAATAATATTAAATCATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGATTTTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTC(58SrRNA)CGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTTGAATTTCTCAAACCCCATGTCTTTTTTAGAGCATGAGCTTTGGAGTTGGGGGCTGCTGGCGGCGAAAAGCCGTCGGCTCTCCTGAAATGCATTAGCAAAGGATGGGGCAAGTCTTTGACGTGCATGGCCTTCGACGTGATAATGATCGTCGTGGCTAGGAGCGTCGGACATGCATGAATCTGTCTGTGCTGCTTCTAATCCCCTA(ITS2)GGCTAGCCTCGGCTTGGTCACTTTTAACTACTAGTTGGTCGTGAGGCTGACGAACGTTGAGTTGGGCTGAGCAAGGCTTTTTGTCTCTATTCAAACCTTGACCTCAAATCAGGTAGAACTACCCGCTGAACTTAACAATATCATAACCGGAAGAAAAA(28SrRNA)

将上述来源于桂东黄菌的ITS序列用GD0001表示(下同)。该序列提交Genbank，得到序列号为HQ651150

从Genbank中搜索出已登录的牛肝菌科多个物种的ITS序列，以Boletusappendiculatus作为外群，构建MrBayes谱系图(图1)。构建方法见图1说明。用Genbank中嵌套的Blast搜索比对软件将GD0001与多种牛肝菌科物种的ITS序列比对知，桂东黄菌的ITS序列(GD0001)与小美牛肝菌(ITS序列号DQ407253，来自云南)和缘盖牛肝菌(ITS序列号GU233428，来自浙江)最为接近，同源性达98%～99% 。

根据图1中后验概率大小与种类的相关性可以看出，凡分枝后验概率在80%以上的，该分枝基本上系同一物种不同个体ITS序列聚集而成。如AY185180，AY185181，AY185182，AY185183，AY185185以96%的后验概率聚为一支，且均为B.dryophillus; HM347664, HM347667,HM347647以99%的后验概率聚为一支,均为B.rhodopurpurues; 与桂东黄菌(GD0001)聚为一支的3个序列DQ407253、GU233427和GU233428，它们虽被序列提交者定名为不同的种，即DQ407253为来源于中国云南的小美牛肝菌(B.speciosus)之ITS序列，GU233427和GU233428为来源于中国浙江省庆元县缘盖牛肝菌(B.appendiculatus)的ITS序列(李海波等，2007)。但它们以79%的后验概率聚为一支，说明其相似性很高，当归入同一物种。这一看似矛盾的结果，可能是提交上述序列的个别作者因形态分类不准确导致的问题。支持这一看法的另一个依据是，图1中HM347641和HM347642两个ITS序列，均由葡萄牙 Tras-os-Montes and Alto Douro大学的G.M.Marques等于2010年5月18日提交,样品为采自欧洲的B.appendiculatus，却独立成支，与GU233427和GU233428有较大差异。从真菌分类命名的可靠性看，个人认为欧洲是现代真菌分类学的发源地，有良好的分类学基础，而我国真菌分类学基础较薄弱，可靠的标本积累少。即使国内少有的几个以收集、研究真菌标本著称的标本馆也多存在误定[4-5],国内对小美牛肝菌等种名的误定也就难免。因此，本文采信出自葡萄牙的缘盖牛肝菌(B.appendiculatus)为正确名称。因出自浙江的所谓“缘盖牛肝菌”ITS序列与来自葡萄牙的HM347641和HM347642两序列并未聚成一支，从而可以认定其非正宗缘盖牛肝菌。考虑到前文描述的桂东黄菌形态特征与B.speciosus的原始描述一致，且有与采自云南的小美牛肝菌序列同源性达98%的事实佐证，本文认为桂东黄菌即是B.speciosus,而浙江所产缘盖牛肝菌也应更正为B.speciosus，即小美牛肝菌。事实上，从形态看，小美牛肝菌与缘盖牛肝菌相比，菌柄较细长，并有伤后更易于变蓝的倾向[6]。

此外，用Clustalx1.8软件对上述各个ITS序列进行比对分析，结果如下：GU233428与GD0001相比,695个对应碱基中,只有7个碱基有差异,占1.007%。其中ITS1区有3个不同碱基，ITS2仅1个碱基不同，28S区仅尾部3个碱基不同。考虑到28S区尾部可能是ITS序列测序时的随机误差，如果将之剔除，则二者的相似度几近100%，说明二者系同一物种。但GD0001与HM34764相比，在661个对应碱基中，共有44个不同位点的碱基有差异，占6.657%。其中ITS1区对应碱基不同的有22个，5.8S区不同的有6个,ITS2区有9个,28S区有7个。说明二者系不同的两个物种，进一步印证了前面的推论。

综合上述形态特征和ITS序列比对及MrBayes软件分析结果，可以确定桂东黄菌为小美牛肝菌(B.speciosus)，属担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，牛肝菌科(Boletaceae)，牛肝菌属(Boletus)。

3 结论与讨论

3.1关于种名的认定

通过桂东黄菌形态特征与B.speciosus模式标本的描述特征相比较，并将其ITS序列与Genbank中的相关序列进行比对分析，可将桂东黄菌的科学名称确定为小美牛肝菌(B.speciosus)。本文的研究证实产自浙江的缘盖牛肝菌系名称误定，应更名为小美牛肝菌。Genbank中的序列号GU233427和GU233428,虽没有说明样品的采集地, 但李海波等(2007)论文中的ITS序列样品已注明来自于浙江庆元县,且除ITS序列前后两尾少数碱基不一外,中间部分与GU233427完全相同，据此推测GU233427的来源样品亦来自浙江庆元。而且李海波等[7]也认定，所测ITS序列与云南的B.speciosus(DQ407253)用Blast软件进行同源性比对，相似度达99%，并认为二者“极为相似”，与本文比对结果一致。该作者实际上对浙江庆元“黄靛牛肝菌”被定名为缘盖牛肝菌是存疑的，认为二者种属关系“尚待进一步研究”。之所以不能定论，是因为标本曾由国内牛肝菌分类专家做过形态鉴定，加之当时Genbank数据库中尚无正宗缘盖牛肝菌ITS序列可供佐证。

图1 牛肝菌科部分种类ITS序列谱系树图Fig. 1 Phylogenic tree of some species belong to Boletaceae with ITS sequences

本文确认产自湖南桂东的黄菌、浙江庆元的黄靛牛肝菌、及云南的小美牛肝菌，尽管地理直线距离彼此相差约500km(庆元至桂东)～1100km(桂东至昆明)，但均系同一物种。由此也可推断，小美牛肝菌不仅分布于美国，也分布于中国云南、湖南、浙江等区域。

3.2关于分子生物学方法对菌物种类鉴别的意义

牛肝菌科的种类繁多，共有13个属[12]，仅牛肝菌属就超过100种。用传统方法对其进行系统分类是令专家也难以面对的巨大挑战。因此，借助分子生物学工具，利用具有分类学价值的DNA特征序列进行辅助鉴别的方法受到分类学和相关学科研究者重视[13-16]。事实上，多基因片断分析在大型菌物系统分类中已成为不可或缺的手段[17-19]。牛肝菌是一个十分复杂的类群，要确切弄清其分类关系，清楚地区分不同种类，需要传统的细微表型特征描述与现代分子生物学手段的完美结合。

3.3加强小美牛肝菌开发的必要性

小美牛肝菌是一种美味食用菌，具有十分重要的经济意义。无论是浙江庆元，还是湖南桂东，都自然形成了当地的传统美食，并成为远近有名的天然山珍，对地方经济和特色文化有积极影响。就桂东县而言，小美牛肝菌的采收、贸易已是产地部分农民家庭收入的重要补充。据我们调查，桂东寨前乡、新坊乡、黄洞乡有的农民家庭每年靠居所附近采收、销售小美牛肝菌，年收入可达12000元，有的近20000元。这一获利方式，不损害环境，是一种可持续的自然生产模式。不仅如此，在这些地区开展小美牛肝菌栽培和增产技术的研究，成功后加以推广，将具有非常重要的经济和社会意义。这一经济发展模式无论对于发达国家还是发展中国家均具有一定的重要性[19-20]，而对于后者的意义更为显著[21]。可喜的是，我国各地均已开始重视该菌种的研究开发，浙江省曾以重点攻关项目和自然科学基金项目支持当地科研机构开展以小美牛肝菌分离鉴定、疏水蛋白功能基因克隆及表达方面的研究工作，丽水市也列项支持仿生栽培研究。湖南省科技厅通过农业成果转化基金项目支持小美牛肝菌菌根苗繁育与栽培技术研究和推广，相关基础工作还列入了国家“863”特殊食用菌产业化关键技术的研究内容。但是，作为一种菌根菌，小美牛肝菌的栽培难度超过迄今已获栽培成功的块菌、红汁乳菇等[15，22]其它菌根性食用菌，这一特点决定了小美牛肝菌的研究需要多学科、多领域的协同合作和持续地项目支持。

致谢：中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员曾阅读此文并提出了宝贵建议，在此谨致谢忱！研究工作中得到桂东县钟建钢副县长、林业局郭远飞局长等大力支持，在此深表感谢。

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RecognitionofthescientificnameofGuidongHuangjunandcorrectionofQingyuanHuangdian

TAN Zhuming1, SHEN Airong1, FU Shaochun2, LIU Xiaojuan3, TANG Shuwen4

(1.Ectomycorrhizal Mushroom Center, Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004， China;2.Mushroom Insitute, Shanghai Academy of Agriculture, Shanghai 201106, China;3.Science and Technology Bureau of Guidong County, Guidong 423500, China;4.Forestry Bureau of Guidong County, Guidong 423500, China)

The Huangjun at Guidong County,Hunan Province was identified with both morphological method and ITS sequence analysis method, and ITS sequence of DNA from mycelia of Huangjun produced at Guidong was compared with that of so calledBoletusappendiculatus(Huangdian) produced at Qingyuan County, Zhejiang Province, and with that ofB.speciosusproduced in Yunnan Province with MrBayes 3.1.2, which was clustered with species from Qingyuan to a clade with posterior rate of 97% in the phylogenic consensus tree and were together clustered withB.speciosusfrom Yunnan to a clade with posterior rate of 79%. However, all of above ITS sequences never clustered withB.appendiculatusfrom European to a clade. The result showed that the scientific name of Huangjun at Guidong County should beB.speciosus, and so-calledB.apppendiculatus(Huangdian) in Zhejiang would be also changed toB.speciosus. It is an effective way to be used for reference to identify those fungi which were difficult to distinguish exactly from each other when lacking of model specimen. In the light of its high edible value and great demanding market, theB.speciosuswould be paid more attention and need more continuing financial support so that further deep and detail researches, such as cultivation, yield improving, and so on, could be done.

Boletusspeciosus;Boletusappendiculatus; ITS sequence; Phylogenic tree; MrBayes

2011 — 02 — 26

2011 — 03 — 09

国家科技部“863”项目(2007AA021506)及湖南省农业成果转化基金项目(2008NK4027)。

S 567.3+9

1003 — 5710(2011)02 — 0009 — 05

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2011. 02. 003

(责任编辑：张珉)