刘良专 游晓星 徐磊 吴移谋

肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建

刘良专 游晓星 徐磊 吴移谋

目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因，构建pGEX-6p-2／Pmp21原核表达载体。方法 筛选Pmp21优势抗原表位，PCR法扩增Pmp21目的基因；并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体；经PCR与测序鉴定。结果 软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列，设计引物PCR法扩增得到目的片段；构建重组质粒经测序鉴定， BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致。结论 成功构建pGEX-6p-2／Pmp21载体，为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础。

肺炎嗜衣原体；Pmp21；载体

肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白（polymorphic membrane proteins,Pmp）的发现是衣原体全基因序列分析的重大成果[1]。发现Cpn有21个基因编码Pmp1～Pmp21[2-4]，其中PmpD (Pmp21)引起了人们的广泛重视[5]。为此，本研究克隆Pmp21优势抗原表位，为探讨其在Cpn感染中的应用奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体 Cpn AR39株、pGEX-6p-2载体南华大学病原生物学研究所保存。

1.1.2 主要试剂与试验动物 限制性内切酶、DNA 聚合酶均为MBI产品、 DNA标准、蛋白质标准MBI公司。

1.2 方法

1.2.1 Pmp6和Pmp21基因序列的获取 登陆互联网登陆（http://stdgen.northwestern.edu/），获取Pmp21碱基序列，其Gene ID为Cpn0963。

1.2.2 Pmp21蛋白优势抗原表位的预测 登陆互联网登陆http://www.expasy.org/tools/protscale.html,输入Pmp21的核苷酸序列，筛选Pmp21优势抗原表位。

1.2.3 原核表达载体pGEX-6p-2/ Pmp21的构建与鉴定 prime 5设计 PCR引物， P1 序列为 5’-CGC GGATCC TCTGCTCATGTTGAAGAGGC -3’， P2序列为5’- TTTTCCTTTT GCGGCCGC CACAATGGGTCACAACAATG-3’，引入 BamHI和 NotI 酶切位点及保护性碱基。PCR反应条件为：95℃ 3min预变性，95℃45s， 53℃ 30s，72℃2.5min，循环28次，72℃延伸8min 终止反应， 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后克隆到pGEX-6p-2上，并转化入E.coli BL21中，经PCR筛选和测序（上海生工公司)鉴定。

2 结果

2.1 Pmp6、Pmp21优势抗原表位预测结果

经Expasy软件分析Pmp21基因的抗原表位结果显示，其整个分子抗原性均较强，存在多个强抗原表位，其亲水性和可及性参数结果如图1、图2。……