林秀椿，高刚峰，陈美高，倪 莉

（1.福州大学生物科学与工程学院食品技术研究所，福建福州350108；2.三明市林业科技推广中心，福建三明365000）

油茶饼粕蛋白提取及抗氧化酶解产物的制备

林秀椿1，高刚峰2，陈美高2，倪 莉1

（1.福州大学生物科学与工程学院食品技术研究所，福建福州350108；2.三明市林业科技推广中心，福建三明365000）

测定油茶饼粕的基本组成；确定茶粕蛋白提取的方法和工艺及其测定方法；通过微生物发酵、酶解等方法生产茶粕蛋白多肽，测定经处理后蛋白分子量分布情况，并测定其清除DPPH·和羟自由基能力。实验表明，茶粕营养丰富，通过碱液水浴浸提可获得18.70%蛋白质，浸提液酶解后可制备具有抗氧化能力的酶解产物，抗氧化能力随着水解时间呈先增后减的趋势，而茶粕经发酵后能得到较大比例的低分子量产物。油茶饼粕的经济价值还有待进一步开发。

油茶饼粕，蛋白质，酶解，抗氧化肽

油茶（Camellia Oleifera Abel）系山茶科山茶属植物，是一种常绿、长寿、果实含油率高的中国特有的油料树种，也是与油棕、橄榄、椰子齐名的四大木本食用油源树种之一［1］。油茶饼粕又称茶饼、茶粕、枯饼等，榨取茶油后剩下的渣饼即是油茶饼粕，其数量相当于茶油的三倍，我国油茶饼粕的年平均产量约为40万t［2］。由于我国油茶茶籽主要采用传统榨油工艺制油，所生产的茶粕中茶皂素、单宁等抗营养因子含量过高，不适宜直接用于动物生产，大部分被用作清塘剂、肥料、燃料，甚至废弃，少量用于茶皂素的提取，极少部分用作饲料。有研究报道茶粕营养丰富，因而茶粕的废弃是资源的极大浪费，甚至对环境也构成了极大压力。目前关于茶粕的研究较少，少数几篇油茶饼粕蛋白提取的研究主要是采用碱提酸沉的方法获得蛋白质，由于不同的蛋白等电点不同，因而该法一般不能得到茶粕中全部的蛋白质。本研究充分利用了茶籽油产品的副产物油茶饼粕，拟通过发酵、酶解等样品处理方式从中获得抗氧化产物，提高其经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶饼粕 沈郎食用油公司提供，粉碎过筛待用；蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D 丹麦NOVE公司；红曲霉、米曲霉、构巢曲霉 实验室分离制备；无水乙醇、HCl、NaOH、石油醚等 均为分析纯。

HH-8型数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；KDN-16C型数控消化炉 上海新嘉电子有限公司；V-1200型可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；MA35型水分快速测定仪 上海精密科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品基本成分测定

1.2.1.1 水分含量测定 使用快速水分测定仪测定茶粕的水分含量。

1.2.1.2 蛋白质含量测定 参考文献［4］，采用半微量凯氏定氮法测定茶粕蛋白质含量。

1.2.1.3 总糖含量测定 根据文献［5-6］，采用蒽酮-硫酸法测定茶粕样品总糖含量。

1.2.1.4 脂肪含量测定 索氏提取法测定茶粕样品脂肪含量。

1.2.1.5 总酚含量测定 参考中国药典中鞣质含量测定方法。

1.2.1.6 灰分含量测定 根据文献［4］所述方法测定茶粕灰分含量。

1.2.1.7 粗纤维含量测定 参考国标GB/T5515中粗纤维含量测定方法。

1.2.2 茶粕蛋白的提取 采用蒸馏水、乙醇水和氢氧化钠溶液三种不同溶剂水浴提取茶粕中的蛋白质，对比不同溶剂浸提的蛋白提取率；此外还对比了水浴前未经处理和高压处理之后的提取效率。

1.2.3 提取工艺条件的优化 分别考察提取温度、提取时间、料液比和提取液浓度等因素对茶粕蛋白提取的影响，设计正交实验确定提取茶粕蛋白最优条件，因素水平表如表1所示。

表1 因素水平表

1.2.4 茶粕蛋白浸提液中蛋白质含量测定 对比茶粕蛋白浸提液中蛋白质含量测定的三种方法：考马斯亮蓝法、福林酚法和凯氏定氮法。

1.2.5 茶粕蛋白水解产物的制备

1.2.5.1 茶粕的酶解工艺 根据确定的提取茶粕蛋白最优工艺对茶粕进行提取蛋白处理，酶解蛋白质浸提液，工艺流程如下：

茶粕浸提液→调pH→加酶恒温水解→灭酶→酶解液

1.2.5.2 茶粕的发酵工艺 采用微生物发酵法制备茶粕蛋白的水解产物，将产酶和酶解两个步骤相结合。选取3株产蛋白酶活力较高的菌种红曲霉、米曲霉、构巢曲霉。

茶粕培养基制备→灭菌→接种→发酵→烘干、粉碎→浸提液

1.2.6 茶粕蛋白水解产物的分离和抗氧化性质的研究

1.2.6.1 隆丁区分法测定茶粕蛋白水解产物的高、中、低分子蛋白分布 其测定原理是高分子含氮物质在酸性溶液中易为单宁所沉淀，磷钼酸可同时沉淀高、中分子含氮物质，低分子含氮物质则不为上述试剂所沉淀。

1.2.6.2 茶粕蛋白水解产物抗氧化活性测定 参照文献［7］，通过使用不同酶对蛋白质的作用得到茶籽多肽对DPPH·和羟自由基清除作用的测定，量化茶籽蛋白多肽抗氧化能力。

茶粕蛋白水解产物DPPH·清除能力测试见表2，清除率计算公式如下：

式中：Ca-2mL DPPH溶液+2mL待测溶液的吸光值；Cb-2mL待测溶液+2mL乙醇的吸光值；C0-2mL DPPH溶液+2mL蒸馏水的吸光值。

表2 茶籽蛋白酶解物DPPH·清除能力测定

茶籽蛋白水解产物羟自由基清除作用的测定按表3的程序操作，添加后振荡混合后静置60min，在510nm波长处测吸光值，清除率计算如下式：

式中：Ao-未加被测物吸光度值；As-加入被测物后吸光度值；Ai-样品自身空白吸光值。

表3 羟自由基清除能力测定操作程序（mL）

2 结果与分析

2.1 茶粕基本成分分析

对茶粕基本组成成分进行分析，其中粗蛋白含量9.78%，总糖含量32.02%，粗脂肪含量8.48%，三大营养物质占50.28%，干重为56.03%，其他数据如表4所示，因此可以说茶粕蛋白中具有相当可观的营养价值有待开发。然而，茶粕中还含有两大抗营养因子茶皂素和单宁，这是茶粕不能被用作动物饲料的重要原因。

2.2 茶粕蛋白提取方法的确定

通过蒸馏水、50%的乙醇溶液、氢氧化钠溶液3种不同的浸提液对茶粕蛋白提取，结果如表5所示，碱提所得蛋白含量明显高于其他两种方法，碱提蛋白质含量达到15.25%，而水提和醇提分别为9.66%、9.55%。

表4 茶粕的基本组成成分（%）

表5 不同提取茶粕蛋白方法的比较

2.3 提取茶粕蛋白最优条件的确定

经过料液比、碱液浓度、提取温度、提取时间四个因素的单因素实验，初步确定提取参数的范围，设计正交实验采用L9（34）正交表进行实验，各因素对其影响的主次顺序为提取时间＞碱液浓度＞提取温度＞料液比。实验结果可知最优水平组合为：提取料液比2%，碱液浓度3%，提取温度80℃，提取时间120min。在此最佳工艺条件下重复实验，计算其平均值18.70%。

表6 提取茶粕蛋白最佳条件正交实验结果

2.4 蛋白提取液中蛋白质含量测定方法的对比

结合表7中数据，综合考虑测定蛋白质含量测定过程中的可操作性、重现性和标准曲线的可靠性，福林酚法测定提取液中蛋白质含量是较佳的选择。

表7 蛋白提取液中蛋白质含量测定方法的对比

2.5 茶粕蛋白水解物制备

按照确定的最优工艺提取茶粕蛋白，在各酶最适作用条件下（如表8），分别添加蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D至蛋白浓度为0.88mg/mL的提取液中进行水解，获得酶解产物。

表8 酶解处理表

2.6 茶粕蛋白水解物的鉴定和分离

2.6.1 茶粕蛋白水解产物的高、中、低分子蛋白分布

隆丁区分法可以初步确定茶粕蛋白水解产物的高、中、低分子蛋白分布，如图1所示，茶粕蛋白酶B酶解液中接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白，可能包括一些低分子蛋白、肽类物质和游离氨基酸；高压处理后再经蛋白酶B作用的酶解液中高分子蛋白含量和中分子蛋白含量分别降低26.07%和38.72%，低分子蛋白含量明显增大，增量达到96.10%，这验证了高压处理有效促进了酶解的结论；发酵后低分子蛋白含量达到49.38%，但是高分子蛋白含量达到48.15%，这可能是由于菌体本身蛋白含量比较高，因此高分子蛋白含量较高。

图1 茶粕蛋白水解产物的高、中、低分子蛋白分布

2.6.2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性 通过测定茶粕中蛋白酶解液的DPPH·和羟自由基清除活性，实验结果表明茶粕中含有抗氧化性物质，由图2可知，清除能力为蛋白酶B＞蛋白酶C＞蛋白酶A＞蛋白酶D＞空白，即蛋白酶B所水解出来的多肽清除DPPH·的能力最强，而空白是不经酶解直接将蛋白浸提液进行DPPH·清除实验，也有一定的清除能力，说明浸提液中本身也含有少量具有抗氧化能力的成分，经过酶解后其抗氧化能力得到了很大的提高，其中经过蛋白酶B酶解后其抗氧化能力提高5.8倍，达到83.33%。

图2 不同蛋白酶解液的抗氧化活性比较

2.6.3 抗氧化活性与水解时间的关系 以蛋白酶B为例，研究抗氧化活性与水解时间的关系。随着酶解时间的推移，DPPH·的清除能力也是随之而变化的，总体的趋势是随着酶解时间的增加，抗氧化性能先增高再降低，从图3中的趋势可以看到，并不是水解程度越高抗氧化活性就越高，这说明蛋白水解物的抗氧化活性成分可能是由几个氨基酸排列形成的具有活性的肽类物质。

图3 水解时间与DPPH·清除活性的关系

3 结论

本研究通过测定茶粕中的基本组成，明确了茶粕可观的营养价值。通过采用碱提、水提和醇提三种方法，从而筛选出适用于茶粕蛋白提取的方法，结果验证了茶粕蛋白中大部分蛋白质易溶于碱液。设计正交实验优化茶粕蛋白提取的工艺条件，最优条件为：提取料液比为2%，碱液浓度为3%，提取温度为80℃，提取时间为120min，其提取效果可以达到18.70%，而在水浴前对茶粕进行高压处理有助于蛋白更好地溶出。按照最优工艺条件对茶粕样品进行提取蛋白，分别选用蛋白酶A、蛋白酶B、蛋白酶C、蛋白酶D四种酶对蛋白提取液进行酶解，测定四种酶的DPPH·和羟自由基清除率，蛋白酶B的效果最好；随着酶解时间的推移，DPPH·的清除能力先增高再降低。酶解后接近一半是中分子蛋白，22.39%是低分子蛋白。此外，发酵后低分子蛋白含量达到49.38%，但是高分子蛋白含量达到48.15%，这可能是由于菌体本身蛋白含量比较高。总之，油茶籽粕作为茶油提取的下脚料，来源充足，具有丰富的营养价值，因而开发其经济价值有广阔的前景。

［1］钟海雁，谢碧霞，王承南.我国油茶加工利用研究现状及分析［J］.林业科技，2001，15（4）：6-8.

［2］国家统计局.中国统计摘要［M］.北京：中国统计出版社，1993：67.

［3］佟云伟，陈凤香，杨波涛.不同食用植物油氧化稳定性的研究［J］.中国油脂，2009（2）：8.

［4］无锡轻工大学，天津轻工业学院.食品分析［M］.北京：中国轻工业出版社，2007.

［5］白玲，黄健.基础生物化学实验［M］.上海：复旦大学出版社，2004.

［6］文赤夫，董爱文，李国章，等.蒽酮比色法测定紫花地丁中总糖及还原糖含量［J］.现代食品科技，2005，21（3）：122-123.

［7］唐勇，赵靖，徐静，等.植物总抗氧化能力的微孔板定量测定及评价［J］.第三军医大学学报，2008，30（6）：517-520.

［8］伍晓春，熊筱娟，陈武.油茶饼粕中植物蛋白的提取分析［J］.宜春学院学报，2008，4（30）：29-30.

Study on extraction of protein and preparation of antioxidative peptide from Camellia Oleifera Abel

LIN Xiu-chun1，GAO Gang-feng2，CHEN Mei-gao2，NI Li1
（1.Institute of Food Science and Technology，Fuzhou University，Fuzhou 350108，China；2.Forestry Scienceamp;Technology Promotion Center，Sanming 365000，China）

Determined the basic composition of the oil-tea Camellia seed cake，found method and technology to extract protein，produced protein peptides through enzymolysis and fermentation，and analysed the distribution of different molecular weight proteins，then determined their inoxidabilities.Experimental data showed that，oil-tea Camellia seed cake had rich nutrition ingredients，through alkaline bath 18.70%protein can be obtained.Enzymatic hydrolysis of leaching liquor turned out to be antioxidative peptides，and DPPH· scavenging activities first increased and then decreased under different hydrolysis time，while the fermentation result got larger ratio of low molecular weight products.The economic value of oil-tea Camellia seed cake still needs further development.

oil-tea Camellia seed cake；protein；enzymolysis；antioxidative peptides

TS272

B

1002-0306（2011）01-0219-04

2009-12-28

林秀椿（1984-），女，硕士，研究方向：食物资源开发与利用。

福建省林业厅科研计划项目基金资助（闽材料2009［8］号）。