刘 超 孙 辉 杨晓亮 何卫江

(南京大学化学化工学院，南京 210093)

一个具有大Stokes位移的苯并噻唑类pH荧光探针

刘 超 孙 辉 杨晓亮 何卫江＊

(南京大学化学化工学院，南京 210093)

本文通过乙烯基将作为荧光团的苯并噻唑与作为H+受体的4-吡啶基桥联构筑了一个基于分子内电荷转移机制的pH荧光探针BTP2。研究表明该探针的Stokes位移为237 nm，远大于相应2-吡啶基类似物BTP1。滴定实验表明该探针的荧光在pH 3.80至5.50之间随pH值增大而增强，且不受其他金属离子的干扰，具有检测胞内酸性细胞器pH的良好前景。探针pKa为4.72，略高于BTP1。4-吡啶基连接导致的更大的Stokes位移表明调节吡啶连接位置可以实现对该类探针分子Stokes位移的调控。

苯并噻唑；pH；Stokes位移；荧光探针

pH值不仅对物质的物化性质及其反应性能有明显的影响，而且在生命体系中也有重要功能。一方面细胞内pH值在细胞增殖和凋亡[1-2]、离子运输[3-4]、内吞[1]和肌肉收缩[5-6]等生理过程中都起着重要的作用。另一方面，pH值的变化同样会通过间隙连接和信号通路等影响突触传递、神经细胞兴奋性和细胞间耦合等神经系统活动[7-8]。细胞内pH值与细胞功能的密切关系意味着对细胞内pH值的精确测量可以为研究小至单个细胞器的生理学和病理学过程提供关键信息[9]。所以，监测细胞内pH值的动态变化对于理解细胞内许多生理功能的机制有着重要的作用[10]。

自Robert Boyle发现石蕊试液具有随pH值变化发生颜色变化的特性以来，各种酸碱指示剂如酚酞、甲基橙以及相关pH试纸得到了广泛的应用。这种比色检测pH值的方法便捷有效，也有较高灵敏度，因此时至今日仍有许多新型pH比色指示剂的报道[11-13]。但是比色法也存在着明显的缺点，无法应用到生命体系进行活体细胞造影。另外，比色法的灵敏度较低，而生命体系要求能检测到微小的pH变化，比如细胞中0.10～0.20个单位pH的扰动就会造成心肺和神经方面的疾病如阿尔茨海默综合症[14-16]以及其他致命的变异[17]。由于荧光探针法具有快速实时响应、对细胞无损伤以及对pH响应灵敏性高等优点，利用荧光探针法对细胞内pH变化进行检测已引起人们的广泛兴趣[18-19]。目前报道的许多pH荧光探针的Stokes位移较小[20-21]，在造影时容易受到激发光的干扰。因此，具有较大Stokes位移的pH荧光探针在生物和化学等方面都具有极大的潜在应用价值。

Stokes位移是分子探针的重要参数，较大的Stokes位移有利于克服激发在荧光造影中的干扰。多种机制可能使分子具有大的Stokes位移,如pH荧光探针1的Stokes位移为118 nm[22]，主要是由于激子发射导致了较大的Stokes位移。分子内电荷转移(intramolecular charge transfer，ICT)效应也可以增大荧光分子的Stokes位移。许多文献报道了利用ICT效应获得具有大Stokes位移的离子荧光探针[23-27]，一般Stokes位移都大于100 nm，其中探针2的Stokes位移更是达到200 nm左右[27]。这一报道显示了ICT荧光团在构建大Stokes位移探针分子方面的优势。我们课题组利用乙烯基桥联荧光团苯并噻唑和作为质子受体吡啶来构建了pH荧光探针BTP1[22]。该分子中在苯并噻唑荧光团上的N，N-二甲基结构作为电子给体，噻唑/吡啶作为电子受体，使 BTP1 具有 D(donor，给体)-π-A(acceptor，受体)的结构特点，其ICT效应使得分子具有较大的Stokes位移(199 nm)[22]，有利于减少造影过程中激发光的干扰。这里我们用4-吡啶结构作为H+受体替代了原来的2-吡啶结构构建了新的pH探针BTP2，希望4-吡啶结构导致的分子极性方向变化可以有效改变分子的D-π-A效应，实现Stokes位移的调控，更好地克服激发光的干扰。这一研究有利于发现通过改变D/A推拉电子能力而调节Stokes位移策略之外的新途径。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

常用药品与试剂均为国产分析纯试剂，使用前未做进一步纯化。光谱性质测试中所用溶剂如甲醇等为光谱纯试剂，购自Aldrich公司。水为MILLIPORE系统处理过的超纯水。电喷雾质谱用LCQ Fleet电喷雾质谱仪 (ESI-MS，Thermo Finnigan)测定，并用ISOPRO 3.0程序模拟其同位素分布模式。1H-，13C-NMR在Bruker DRX 500型超导核磁共振仪上用标准脉冲序列测定 (298 K)。紫外光谱用UV3600型紫外-红外分光光度计测定。荧光光谱在FS_LS55发光光谱仪上测定。pH值用PHS-3精密pH计记录。

1.2 探针的合成和表征

探针BTP2的合成路线如式1所示。6-N，N-二甲基氨基-2-甲基苯并噻唑根据文献方法[22]合成得到。分别称取一定量的6-N，N-二甲基-氨基-2-甲基苯并噻唑(0.259 g，1.35 mmol)和 4-吡啶甲醛(0.159 g，1.48 mmol)到 50 mL 圆底烧瓶中，加入 6 mL DMF后搅拌溶解。加入 KOH 固体粉末 (0.378 g，6.75 mmol)后室温搅拌反应24 h。TLC跟踪确认完全反应后向反应液中加入H2O(5 mL)，混合溶液用CH2Cl2萃取(10 mL×3)。合并的有机相经无水硫酸镁干燥后，减压脱溶获得红色固体。硅胶柱层析分离(V乙酸乙酯/V二氯甲烷=1/10)后得橙红色固体产物 0.12 g，收率32%。

1.3 BTP2的光谱性质测试

BTP2用光谱纯MeOH配成5 mmol·L-1储备液放置于4℃冰箱中备用。取BTP2储备液用光谱纯MeOH 和 HEPES 缓冲溶液(50 mmol·L-1，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)稀释成 5 μmol·L-1的溶液(VMeOH/VHEPES=1/9)，然后分别测定荧光光谱和紫外-可见吸收光谱。以硫酸奎宁作为基准物[28]，测量BTP2的量子产率。测定所用溶液浓度以使对应荧光激发波长处吸光度小于0.05为准。硫酸奎宁以0.05 mol·L-1硫酸溶解稀释，BTP2则在 MeOH/HEPES体系(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)中测量。硫酸奎宁的荧光发射光谱在358 nm波长激发下测定，BTP2则以378 nm波长的激发光激发。分别测量得到两个溶液的紫外-可见吸收光谱与荧光光谱后，将数据代入如下公式进行计算[29]：

公式中下标R与S分别代表基准物与样品，Фf表示量子产率，F表示化合物溶液荧光发射光谱的积分面积，A表示相应激发波长处的吸光度，n为样品溶液的折射系数。

BTP2的pH滴定实验在MeOH/H2O体系(VMeOH/VH2O=1/9)中进行。储备液用光谱纯MeOH和MILLIPORE处理过的H2O稀释，加入不同体积的HCl和NaOH水溶液调节pH，最后混合溶液浓度都为5 μmol·L-1。每次加完充分混合后先用pH计测量溶液pH，再进行荧光光谱测试或紫外-可见吸收光谱测试 (参比溶液为空白的MeOH/H2O溶液，VMeOH/VH2O=1/9)。

金属离子干扰实验在MeOH/HEPES体系(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)中进行。实验中探针最终浓度为5 μmol·L-1，碱金属、碱土金属浓度为化合物浓度的1000倍，其余金属离子浓度与化合物浓度相等。充分混匀后进行光谱测试。

2 结果与讨论

2.1 BTP2的吸收和发射光谱

首先在MeOH/HEPES(VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20)溶液中研究了 BTP2(5 μmol·L-1)的光谱性质。紫外-可见光谱研究表明BTP2在中性条件下的最大吸收峰为388 nm左右，该吸收峰应该是由于苯并噻唑的π-π*跃迁引起的。荧光光谱测试结果表明BTP2在中性条件下的最大发射波长和最大激发波长分别为615 nm和378 nm左右，Stokes位移达到237 nm，远大于BTP1中的199 nm，也大于大部分探针分子的Stokes位移，有利于荧光探针在细胞造影中的实际应用。显然4-吡啶结构的引入，有效地调整了分子极性方向，有利于荧光增大分子内的电荷转移效应，增大了Stokes位移。这说明分子极性方向同分子电荷转移方向的一致能进一步稳定激发态分子，增大Stokes位移，这显然为该类分子通过调节吡啶连接位置调控Stokes位移克服激发干扰提供了新思路。另一方面，利用硫酸奎宁作为基准物质，测量得到BTP2的量子产率为0.062。

2.2 BTP2的pH荧光滴定与紫外-可见光滴定

BTP2的荧光pH滴定在含有10%(V/V)甲醇的水溶液中进行，使用的激发波长为378 nm。从图2b所示结果可以看出，当pH值高于3以上时，荧光强度逐渐增强。更高的pH值导致荧光迅速增强，但pH＜3.80 时 BTP2 的荧光强度仍然较弱。在 pH＞5.50时荧光增加已较小，如从pH 5.50升至pH 5.70，荧光增强仅有～6%左右。在pH＞6.0时，荧光强度已没有明显变化。取pH分别为3.07和5.50时在615 nm处的荧光强度做比较，增强倍数超过100倍，即使以pH分别为3.77和5.50时615 nm处的荧光强度做比较，增强倍数仍超过30倍。在整个pH滴定过程中，最大激发波长和最大发射波长并未发生移动。利用615 nm处的荧光强度对pH作图，并用Henderson-Hasselbach方程进行曲线拟 合[30]，得到BTP2的pKa值为4.72，与溶酶体等酸性细胞器的pH值接近，说明BTP2具有检测溶酶体内pH变化的潜在应用前景。

BTP2的紫外-可见吸收光谱受pH变化影响相对比较复杂(图 4)。在 pH＞5.5时，紫外-可见吸收峰略有增强，在pH 6.00以上则基本不变，这种pH效应类似于其荧光在该pH范围内的变化趋势。当pH 逐渐从 5.5 减小到 4.06 时，388 nm 处的 π-π*跃迁峰吸收强度逐渐减弱，而443 nm处的吸收峰逐渐出现并升高。在此过程的等色点表明了1个质子化过程。pH值继续降低时443 nm处的吸收峰逐渐减弱，并在345 nm处出现1个新的吸收峰，pH降到1.88左右，443 nm处吸收峰完全消失。在这一过程中，在300 nm和380 nm处出现2个等消光点，表明在这一阶段的pH变化过程中，也只有1个质子化反应发生。伴随着BTP2复杂的紫外-可见光谱变化的是溶液随pH变化的溶液颜色。由图5所示BTP2溶液变化可以看出，在近中性条件下，BTP2溶液为黄色，pH降至5.12左右，溶液颜色一直无明显变化，pH进一步降低，溶液颜色开始变红，直至pH为4.03左右时，溶液颜色达到最深，然后随着pH的继续降低，溶液颜色变淡，直至无色。这一变化过程与紫外-可见吸收光谱体现的2个接近相反的变化过程是一致的。这显示BTP2还有一定的pH比色传感的能力。根据BTP1的质子化过程，对于BTP2我们可以推测存在2个质子化过程：首先是pH 5.5到pH 4.06间的吡啶氮质子化过程，该过程增强了分子拉电子区域的拉电子效应，使得ICT吸收带明显红移。在pH 4.06到pH 1.88这一过程中，N，N-二甲基被质子化，导致该基团的给电子能力急剧下降，ICT带接近消失，而芳香环本身的 π-π* 吸收带逐渐明显。 从 pH 5.5～7.4 之间荧光和紫外光谱变化来看，BTP2的量子产率在此区间变化不大。另一方面，在探针pH响应范围pH 3.8～5.5之间量子产率随 pH明显上升，通过测定pH 5.5 和 pH 7.2 紫外和荧光光谱进行计算，pH 5.5时的量子产率为0.044。

2.3 BTP2与H+结合方式

为了进一步研究BTP2与H+的作用方式，我们对BTP2在不同的pH(pH=pD-0.4)[31]下进行了核磁滴定实验。BTP2用CD3OD与D2O的混合溶剂溶解，以DCl与NaOD调节pH。图6所示BTP2的核磁滴定图中，氢质子信号相应归属已据式1直接标注其上。可以看出BTP2的所有质子在pH高于5.01时位移无明显变化，当 pH 从 5.01降到 3.91时，吡啶质子Ha和Hb以及近吡啶烯键质子Hc信号均向低场发生了明显的移动，Ha从 8.56移动到8.60 ppm，Hb从 7.66(信号与双键 Hc重合)左右移动到7.77 ppm。Hc的核磁信号也从7.66左右移动到了7.72 ppm，其他氢质子信号皆无明显变化。这一结果说明在此pH变化过程中仅吡啶环上的N原子发生了质子化。这也与紫外滴定过程是一致的。pH从3.91继续下降到2.49，所有的氢质子信号都开始向低场移动，Ha从8.60移动到8.72 ppm，Hb从7.77移动到8.17 ppm，Hc从7.72移动到7.95 ppm，Hd从7.41移动到7.54 ppm，He从7.81移动到7.87 ppm，Hf从 7.21移动到 7.29 ppm，Hg从 7.07移动到7.14 ppm，Hh从3.06移动到3.10 ppm。在这一个pH变化过程中虽然吡啶环以及桥联双键上的氢质子信号变化仍然较大，不同的是N，N-二甲氨基上的氢质子信号也发生了明显变化。我们推测是N，N-二甲氨基发生质子化，一方面使得直接相连的邻位甲基质子化学位移向低场移动，同时由于N，N-二甲氨基上由给电子基经质子化转为拉电子基，使得整个共轭体系的电子云密度下降，因此吡啶和乙烯基上的质子信号同样向低场移动。结合荧光光谱对pH的变化可知，在pH从5.50降至3.77时过程中主要是吡啶N原子的质子化导致了荧光随pH降低而逐渐淬灭，这与文献报道过的情况相一致[32]。pH继续下降则导致N，N-二甲氨基彻底质子化，整个分子不再具有D-π-A结构，不再具有分子内电荷转移效应，因此荧光几近于消失。

2.4 BTP2对H+的选择性响应研究

一个具有良好响应性能的pH探针在实际应用到细胞或环境中，应该不受体系其他因素的干扰，比如不受金属离子的干扰。对此，我们在MeOH/HEPES 体系 (VMeOH/VHEPES=1/9，50 mmol·L-1HEPES，100 mmol·L-1KNO3，pH=7.20) 的混合溶液中 ，对BTP2与各种金属离子响应性能进行了研究。实验结果显示 (图7)，溶液中与BTP2等浓度的Ag+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Pb2+和 Zn2+等过渡金属离子的存在不会对BTP2的荧光产生明显的影响，因此不会对其pH荧光响应性能产生干扰。另外细胞中具有较高浓度的 K+、Na+、Ca2+和 Mg2+等碱金属和碱土金属离子即使在过量1000倍的浓度情况下，也不会对BTP2的荧光产生明显的改变。因此细胞中的这些高浓度离子同样不会对BTP2的pH响应能力产生干扰。显然BTP2和BTP1一样具有良好的pH响应专一性，符合应用到细胞内检测pH变化的要求。

3 结 论

利用乙烯基将苯并噻唑荧光团与4-吡啶环桥联，得到了一个具有D-π-A结构的荧光探针BTP2。该探针的pKa为4.72，荧光在pH 3.8到5.5的变化范围内随pH增大而增强，并且常见金属离子的存在不会对其pH响应性能造成干扰，适用于胞内酸性环境如溶酶体等的pH检测。该探针具有比相应2-吡啶类似物BTP1更大的Stokes位移，可以更好地克服激发光的干扰，同时也表明该类探针分子可以通过调节桥联吡啶连接位置来调节其Stokes位移。探针的量子产率虽然不高，但利用当前日臻成熟的造影设备已经可以轻松实现细胞造影。本研究同时表明利用ICT荧光团构建各类荧光探针时必须考虑推拉电子基团的位置，以获得较大的分子极性，促进光致电荷转移，获得较大的Stokes位移，降低激发在造影中的干扰。

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A New Benzothiazole-Derived pH Fluorescent Sensor of Large Stokes Shift

LIU Chao SUN HuiYANG Xiao-Liang HE Wei-Jiang＊
(State Key Laboratory of Coordination Chemistry,School of Chemistry and Chemical Engineering,Nanjing University,Nanjing 210093,China)

A new intramolecular charge transfer pH fluorescent sensor BTP2 was constructed by vinyl bridging benzothiazole fluorophore with the H+acceptor,4-pyridyl group via a vinyl group.Emission spectroscopic study disclosed that this new compound has a Stokes shift of 237 nm,which is much larger than that of its analogue BTP1 of 2-pyridyl group.Titration experiment indicated that the emission of BTP2 increases with pH in the pH range from 3.80 to 5.50.Moreover,this pH sensing ability is not interfered by the coexisting metal cations,which provides BTP2 the potential for intracellular pH imaging of acidic organelles.Its pKais around 4.72,slightly larger than that of BTP1.The 4-pyridyl group induced larger Stokes shift implies that altering the bridging site of pyridyl group might be an effective means to regulate the Stokes shift of these pH probe.

benzothiazole;pH;Stokes shift;fluorescent sensor

O

A

1001-4861(2011)11-2121-07

2011-00-00。收修改稿日期：2011-00-00。

国家自然科学基金(No.20871066、10979019、21021062)、国家重大基础研究发展计划项目(No.2011CB935800)、江苏省自然科学基金(No.BK2009227)和中央高校基本科研业务费专项资金资助项目。

＊通讯联系人。 E-mail：heweij69@nju.edu.cn