王凤平,陈 清,吴奎海,俞守义,王 前,芮勇宇＊

(南方医科大学1.南方医院检验科;2.公共卫生与热带医学学院流行病学系,广东广州510515)

大肠埃希菌是临床分离最常见的病原菌之一。近年来由于抗生素的广泛应用及滥用,大肠埃希菌的耐药情况越来越严重,多重耐药的菌株越来越多[1,2],给临床治疗带来了极大的困难。为此,本研究对临床分离大肠埃希菌药敏进行分析,并对其耐药机制进行研究,如整合子、插入序列共同区(insertion sequences common regions,ISCR/orf513)和产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)等,同时用肠杆菌科间的重复序列(Entrobacter repetive intergenic consensus,ERIC)-PCR对菌株基因多态性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 2008年7月-2009年6月从本院患者送检标本中分离出535株大肠埃希菌,经BD pheonix 100全自动微生物分析仪进行鉴定及药敏实验。从中选出99株进行整合子、ISCR、ESBLs(TEM、SHV、CTX)研究及分析,阳性对照为预实验中 PCR阳性并经测序验证的菌株,菌株号为NF813152(I类整合酶),NF511434(ISCR),NF601074(TEM),NF5274(SHV)和NF512990(CTX),阴性对照为大肠埃希菌标准株ATCC25922。

1.1.2 试剂 dNTPs、TaqDNA聚合酶、蛋白酶 K和DNA Marker由大连瑞真生物技术有限公司提供;引物由上海英潍捷基贸易有限公司提供;Tris饱和酚、氯仿、10%十二烷基硫酸钠(SDS)等由广州鼎国生物技术有限公司提供。

1.1.3 仪器 Eppendorf公司的DNA扩增仪;Bio-Rad公司的凝胶成像仪。

1.2 方法

1.2.1 药敏分析 用WHONET5.4分析535株大肠埃希菌的药敏情况,用SPSS13.0统计软件进行χ2检验。

1.2.2 菌株基因组DNA的抽提 用SDS-蛋白酶 K-酚-氯仿方法进行提取。

1.2.3 PCR检测整合子、ISCR、ESBLs(TEM、SHV、CTX)基因 引物见表1,反应体系总体积20μl,其中10×PCR缓冲液 2μl,MgCl21.25μl,dNTP 1.6μl,引物各0.5μl,DNA模板0.5μl,TaqDNA聚合酶1 U,灭菌双蒸水14μl。I类整合酶的反应条件为95℃预变性5min;94℃变性30 s,50℃退火40 s,72℃延伸40 s,30个循环;72℃延伸5 min。……