祝 贺,崔满华,杜珍武,张 勇,邹颖刚

(吉林大学1.第二医院妇产科吉林长春130041;2.中日联谊医院中心研究室;3.白求恩医学院病理生理教研室)

随着分子生物学和基因技术的发展,基因治疗为卵巢癌患者带来了希望,而基因靶向治疗成为当今卵巢癌基因治疗的新热点。卵巢特异启动子-1(Ovarian-specific promoter,OSP-1)在卵巢癌中的特异表达已得到证实[1]。白细胞介素-24(Interleukin-24,IL-24)是一种新型的细胞因子,既能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,又能参与机体的免疫调节系统,是一个理想的治疗功能基因。本实验旨在构建OSP-1调控下的IL-24基因表达载体,为探讨IL-24靶向基因治疗卵巢癌提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

OSP-1基因启动子片段由上海生工生物工程技术服务有限公司合成并克隆入 PUC57质粒,pcDNA3.0真核质粒载体由吉林大学中日联谊医院中心研究室惠赠;DH-5α大肠杆菌感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 主要试剂

TaqDNA酶、T4DNA 连接酶、dNTP、PMD-18T载体试剂盒、DNA Marker及各种限制性内切酶均购自大连宝生物工程有限公司;RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、质粒小量抽提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

1.3 IL-24基因扩增引物的设计

根据Genbank中发表的 IL-24基因cDNA序列(NM-006850.2),利用Primer5.0引物设计软件设计引物 ,上游引物:5’-GGA TCC GCC ACC ATG AAT TTTCAA CAGAGC-3’,下游引物:5’-CTC GAG TCA GAGCTTGTA GAA TTTC-3’,扩增的IL-24片段长度为639 bp。上游引物5’端添加BamH Ⅰ酶切位点、Kozak序列及ATG起始密码子;下游引物5’端添加XhoⅠ酶切位点。

1.4 IL-24基因克隆

取新鲜的人外周血5 ml,应用淋巴细胞分层液进行单个核细胞分离,刀豆蛋白刺激72 h后,提取全细胞mRNA,逆转录成为cDNA。……