王保忠

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最常见的并发症之一，肾小球系膜细胞(MsC)功能的研究对阐明DN发病机制具有重要意义。近年研究表明转化生长因子(TGF-β1)在DN发病机制中起重要作用。肝细胞生长因子(HGF)能有效抑制与慢性肾脏疾病及慢性肾功能衰竭密切相关的肾间质纤维化的进展过程。本研究以大鼠肾小球系膜细胞(RMC)为靶细胞，用高糖诱导造成体外培养的RMC功能紊乱，观察RMC的增殖情况、TGF-β1的分泌变化以及 HGF干预作用，以阐明HGF对糖尿患者肾脏可能具有的保护作用，为DN的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 大鼠肾小球系膜细胞(RMC)的培养与处理 RMC常规复苏后移入细胞培养瓶中静置培养。培养2～3 d，用2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞传代。RMC由中国医学科学院基础医学研究所提供。

1.2 MTT法测细胞增殖 将RMC接种于96孔板，按以下分组给药:①正常对照组(用DMEM培养液培养细胞，葡萄糖终浓度5.5 mmol/L)，②高糖组(DMEM培养液中加入D-葡萄糖，葡萄糖终浓度25.0 mmol/L)，③高糖+HGF组(25.0 mmol/L葡萄糖，50 ng/ml HGF)，加入相应培养液培养不同时间(12，24，48，96 h)，每组设6个复孔。反应结束后每孔加入25 μlMTT(5 mg/ml)溶液，继续孵育4 h，弃上清，每孔加入100 μl二甲基亚枫(DMSO)，振荡30 min后于酶标仪490 nm处测光吸收(OD)值。OD值越大，表明细胞增殖越旺盛。

1.3 酶联免疫吸附技术测细胞上清液中TGF-β1水平 (1)TGF-β1分泌检测分组:将RMC接种于96孔培养板中，分为3组:①正常对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L);②高糖组(葡萄糖浓度25.0mmol/L)，甘露醇对照组 (20.0mmol/L甘露醇，使其渗透压与高糖组相同)。分别于培养的12、24、48、96 h收集细胞，用双抗体夹心法(ABC-ELISA)检测TGF-β1分泌量。每组均设6个复孔。另外将RMC分为:①正常对照组(葡萄糖浓度5.5mmol/L)，②高糖组(葡萄糖浓度25.0mmol/L)③高糖+HGF组(葡萄糖浓度25.0mmol/L，HGF浓度分别为25、50、100、200ng/ml)。……