徐 鹤，张海悦，*，蔡 苗

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012;

2.吉林省军队离退休干部疗养中心，吉林长春 130061)

超声波辅助提取马齿苋总生物碱的研究

徐 鹤1，张海悦1，*，蔡 苗2

(1.长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012;

2.吉林省军队离退休干部疗养中心，吉林长春 130061)

研究了超声波辅助提取马齿苋生物碱的最佳工艺。在单因素实验的基础上，通过响应面研究乙醇浓度、料液比、超声波作用时间和回流时间对生物碱得率的影响。经过优化后的最佳提取工艺参数为:乙醇浓度为95%，料液比为1∶10(g/mL)，超声波作用时间为15min，回流时间为1h。

马齿苋，生物碱，超声波提取，响应面

马齿苋(Port ulaca oleracea L.)，又名马舌菜、长命菜等，为马齿苋科植物全草，遍布全国，《本草图经》称其为“五行草”。马齿苋是我国87种药食同源的野生植物之一，在民间应用历史悠久，它不仅有清热、解毒、消炎、利尿等功效，而且含有丰富的营养成分［1］。马齿苋中的有效成分如生物碱、多糖、黄酮、蒽醌等［2］，具有防治心血管疾病、降血脂、抗衰老等作用。近年来研究表明，马齿苋不仅具有抗心血管疾病和抗氧化的功效，而且具有抗癌的作用，许多生物碱是抗癌的有效成分［3－5］。白冰［6］等人研究马齿苋的活性成分对α－葡萄糖苷酶抑制作用，结果表明马齿苋总碱的抑制率高达80%。目前，英国、法国与荷兰已先后育成蔬菜专用马齿苋优良品种，美国已将马齿苋作为保健食品广为开发［7］。超声波萃取中药材活性成分的优越性是基于超声波的特殊物理性质，与传统提取工艺相比，超声波萃取具有较为突出的特点。利用超声波处理产生的乳化、扩散、击碎、振荡等多级效应，加速活性成分的转移、扩散，从而提高浸出效率及产品纯度［8－9］。响应曲面法是统计设计实验技术的合成，已被广泛地应用在诸多工艺优化控制领域。响应曲面法可以帮助建立一个或多个测定指标与关键影响因素之间的关系模型，并可以进行定量分析［10］。目前，对马齿苋生物碱的研究报道较少，为此该文以马齿苋为原料，研究马齿苋生物碱提取效果的影响因素，从而确定了马齿苋总生物碱提取的最佳工艺及工艺参数，为马齿苋的进一步开发利用奠定了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马齿苋全草 新鲜野生，采摘于吉林省长春市高新区，将马齿苋全草洗净晾干，然后用多功能食物料理机将其粉碎至粉末状，过80目标准筛，备用;石油醚(分析纯) 天津化学试剂有限公司;盐酸(分析纯) 北京化工厂;乙酸乙酯(分析纯) 哈尔滨市新达化工厂;氯仿、氨水(化学纯) 开原市化学试剂一厂;碘化铋钾(分析纯) 天津市光复精细化工研究所;无水乙醇(分析纯) 淄博市临淄云天化工厂。

电子天平 AL104，梅特勒－托利多仪器有限公司;电热恒温水槽 DK－8D型，上海医用恒温设备厂;旋转蒸发器 RE－52型，上海亚荣生化仪器厂;红外光谱仪 Spectrum One FTIR型，美国 Perkin Elmer仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 马齿苋生物碱提取液的制备 准确称取50g马齿苋粉末，放入500mL烧杯中，室温下浸泡1h后，在实验设计要求的条件下回流提取(水浴温度使得乙醇微沸)，提取结束后，滤液用旋转蒸发器减压浓缩至膏状，放冷，加3%HCl 100mL溶解，抽滤除去不溶物。提取液用氯仿25mL萃取两次，弃去氯仿层。用浓氨水调pH9～10，加入25mL乙醚萃取三次，弃去乙醚层。再加入30mL氯仿萃取，每次萃取30min，直至无生物碱为止，合并萃取液后用旋转蒸发器减压蒸干，回收溶剂，用20mL甲醇将容器壁上的萃取物溶解，置于超声波清洗器中洗脱备用。

1.2.2 马齿苋生物碱最大吸收波长的确定 取处理后的样品1mL，加入5mL氯仿及1mL溴甲酚绿缓冲溶液于分液漏斗中，摇匀、静置，取4mL氯仿层于刻度试管，加入1mL无水乙醇，摇匀，在UV2550紫外可见分光光度计上测定马齿苋生物碱的最大吸收波长为620nm。

1.2.3 提取液吸光度的测定 通过紫外可见分光光度计测定提取液在最大吸收波长下的吸光度值。由于缺少马齿苋生物碱的标准品，本文通过测定吸光度来评价提取效果。

生物碱可与溴甲酚绿等显色剂反应生成难溶于水的显色络合物，对于大多数生物碱可采用此法作为提取效果的评价指标。而本文通过全波长扫描图得到马齿苋生物碱与显色剂反应后的最大吸收波长为620nm，根据文献报道，此处为生物碱络合物的特征吸收峰，且这与王仲英等［11－12］的研究结论(634nm)相近，因此可用此波长测定马齿苋生物碱的含量。

1.3 单因素实验

以最大波长620nm处的吸光度值为指标，研究料液比、超声波作用时间、回流时间、乙醇浓度各个因素的影响规律。

1.4 响应曲面优化实验

采用Design－Expert软件研究乙醇浓度、超声波作用时间、回流时间、料液比各个因素的影响规律。采用中心组合BoxBehnken设计方案，采用4因素3水平的响应面表安排实验，见表1。

表1 响应面设计因素与水平

1.5 红外光谱的测定

提取液经旋转蒸发仪挥发除去甲醇，经干燥后，取1mg样品与少量的KBr研磨，以压片法在4000～400cm－1的区间进行红外光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 定性检测结果

采用生物碱沉淀试剂对马齿苋粗提液进行化学成分检识。向马齿苋萃取液中分别加入碘化铋钾试剂和碘－碘化钾试剂，观察反应现象。加入碘化铋钾试剂生成黄褐色沉淀，加入碘－碘化钾试剂后生成棕红色沉淀，根据实验现象可确定萃取液中含有生物碱［13］。

2.2 单因素实验及分析

2.2.1 料液比对生物碱提取效果的影响 在乙醇浓度为75%，室温浸泡1h后，超声波作用10min，回流提取1h，研究不同料液比对马齿苋生物碱提取效果的影响，结果见图1。

图1 料液比的影响

由图1可知，当料液比为1∶10时提取效果最佳。

2.2.2 超声波作用时间对生物碱提取效果的影响在乙醇浓度为75%，料液比为1∶10，室温浸泡1h后，回流提取1h，研究超声波作用时间对马齿苋生物碱提取效果的影响，结果见图2。

图2 超声波时间的影响

由图2可知，超声波作用时间10min时提取效果较好，延长时间，提取效果反而有降低的趋势，所以超声时间选择10min为宜。

2.2.3 回流时间对生物碱提取效果的影响 在乙醇浓度为75%，料液比为1∶10，室温浸泡1h后，超声波作用时间为10min，研究不同回流时间对马齿苋生物碱提取效果的影响，结果见图3。图3结果表明，回流时间为2h时，生物碱提取的效果达到最大，延长时间其变化趋于平缓，从节约能源及工作效率等角度考虑，最佳时间选择为2h。

图3 回流时间的影响

2.2.4 乙醇浓度对生物碱提取效果的影响 在料液比为1∶10，室温浸泡1h后，超声波作用10min，回流提取2h，研究乙醇浓度对马齿苋生物碱提取效果的影响，结果见图4。

图4 乙醇浓度的影响

由图4可以看出，随着乙醇浓度的增加，提取效果显著增加，当乙醇浓度为85%时，生物碱的提取效果达到最佳，故本实验选用最佳的乙醇浓度为85%。

2.3 响应面实验结果与分析

在单因素实验结果基础上，采用中心组合BoxBehnken设计方案，以马齿苋总生物碱提取率为指标，研究乙醇浓度、超声波作用时间、回流时间、料液比各个因素的影响规律，结果见表2。

表2 响应面分析方案及实验结果

四个因子经回归拟合后，各实验因子对响应值的影响可用如下回归方程表示:

由表3可知，上述模型的一次项A不显著，B、C显著，而D极为显著;二次项B2、C2显著，而D2极为显著;交互项BD显著。模型的F值为42.27，整体模型的显著水平p＜0.0001，表明该模型显著。模型的R2为0.9769，R2(Adj)为0.9538，说明回归方程的拟合程度良好，失拟较小，可以用该方程代替真实实验点进行分析。

按照得到的数学模型绘制响应曲面图，见图5。

图5 各因素对提取率影响的响应面图

图5直观地给出了各个因子交互作用的响应面和等值线分析图。从响应面的最高点和等值线可以看出，在所选范围内存在极值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。从图中可以直观地看出，乙醇浓度、回流时间、超声波时间及料液比对马齿苋生物碱的提取率都有影响，除乙醇浓度外其他因素影响都较明显，特别是料液比与提取时间的交互作用影响较大，在响应曲面图中表现为曲面坡度大，变化明显。

2.4 条件优化

从响应面可以看出，最佳值点并不在实验设计范围内，故对边界值和求得的极值进行分析，得到最优的提取条件为 A=94.96%，B=1.00h，C= 15.00min，D=1∶10.00，Y=0.828474。按照以上条件(A=95%，B=1h，C=15min，D=1∶10)进行验证实验，重复三次。其平均A620为0.830，与理论预测值相符。

2.5 生物碱红外光谱图

取上述纯化生物碱少许，与KBr混匀，以压片法测定红外光谱图，见图6。

由图6可知，3435cm－1处可能是酰胺的N－H伸缩振动引起的吸收峰，2398cm－1可能为－N－H伸缩振动引起的吸收峰，1630cm－1可能是酰胺的C=O伸缩振动引起的吸收峰，1385cm－1可能是酰胺C－N的伸缩振动引起的吸收峰，825cm－1可能是C－N弯曲振动引起的吸收峰［14］。从谱图分析其结果，该物质可能为酰胺类结构，基本符合生物碱的特征结构，从而确定提取出的主要成分可能为生物碱类物质。

表3 生物碱得率回归模型方差分析表

图6 生物碱红外光谱图

3 结论

超声波辅助提取技术作为一种天然产物活性成分分离提取的新技术，具有方便、高效的特点和较高的实用价值，其对马齿苋中总生物碱的提取具有高效率、无污染等优点，为工业化生产生物碱产品提供了有益的参考。Design－Expert处理系统是集操作简单、界面可视化、功能强大于一身的统计分析软件。经过优化后的最佳提取工艺参数为:乙醇浓度为95%，料液比为1∶10，超声波作用时间为15min，提取时间为1h，此时，马齿苋生物碱的提取效果最佳。此法使得马齿苋总生物碱的得率得到了很大的提高［15］，其原因可能是超声波作用而引起的，且本文采用了先进的分析软件进行了分析，快速有效地确定了最佳提取条件。此工艺杂质较少，易于分离，为下一步的分离纯化及功能性研究奠定了一定的基础。

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Study on ultrasonic extraction technology of total alkaloids from Portulaca oleracea L.

XU He1，ZHANG Hai－yue1，*，CAI Miao2
(1.College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，China;
2.The Retired People in Army Residents of Jilin，Changchun 130061，China)

The extraction process of total alkaloids from Portulaca oleracea L by the ultrasonic extraction was studied.Based on single factor test，response surface methodology(RSM)was used to study effects of ethanol concentration，solid－liquid ratio，extraction time and ultrasonic extraction time on extraction rate of total alkaloids. The best extraction conditions were determined as below:ethanol concentration 95%，ratio of the material－liquid 1∶10(g/mL)，ultrasonic extraction time 15min，extraction time 1h.

Portulaca oleracea L.;alkaloids;ultrasonic extraction;response surface method

TS201.1

B

1002－0306(2011)07－0316－04

2010－07－15 *通讯联系人

徐鹤(1984－)，女，研究生，主要从事功能食品及农副产品的深加工方面的研究。