周 希， 黄晓燕， 陈长曦， 陈必成， 龚永生， 杨德业△

(温州医学院1附属第一医院心内科, 心血管生物和基因研究所，2附属第一医院外科实验中心,3基础学院机能实验中心，浙江 温州 325000)

Pax-8基因真核表达载体的构建及其功能的初步研究*

周 希1， 黄晓燕1， 陈长曦1， 陈必成2， 龚永生3， 杨德业1△

(温州医学院1附属第一医院心内科, 心血管生物和基因研究所，2附属第一医院外科实验中心,3基础学院机能实验中心，浙江 温州 325000)

目的构建大鼠Pax-8基因全长序列的真核表达载体pcDNA3.1(+)，并将重组质粒转染至心肌细胞系H9c2中进行表达，测定转染后Pax-8基因对心肌细胞增殖及凋亡的影响。方法酶切pCMV sport6-Pax-8获得大鼠Pax-8全长基因，通过基因重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建重组质粒pcDNA3.1(+)-Pax-8。限制性酶切鉴定和DNA测序鉴定插入片段。将重组质粒经脂质体法转染至大鼠心肌细胞系H9c2细胞中，RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后Pax-8 mRNA及蛋白表达水平。CCK-8法检测细胞增殖；以血清饥饿诱导心肌细胞凋亡，同时进行Pax-8质粒转染，流式细胞仪检测细胞凋亡指数，Western blotting法检测活化caspase-3的表达。结果成功构建了大鼠pcDNA3.1(+)-Pax-8真核表达载体，且证实转染后心肌细胞的Pax-8 mRNA 及蛋白表达均明显高于空白对照组(P<0.05)及空质粒组(P<0.05)。转染Pax-8基因能提高心肌细胞的增殖能力(P<0.05)，明显抑制血清饥饿引起的细胞凋亡(P<0.01)，同时下调活化caspase-3的表达(P<0.01)。结论通过基因重组技术成功使得Pax-8基因在心肌细胞中过表达。Pax-8基因可能通过促进心肌细胞增殖及抑制心肌细胞凋亡从而参与胚胎心脏发育的过程。

基因，Pax-8; 真核表达; 细胞凋亡; 细胞增殖

室间隔缺损是最常见的先天性心脏病之一。尽管胚胎心脏发育已成为近年来国内外学者的研究热点，但其确切的分子机制至今仍然知之甚少。近年，国外的研究表明：骨形态发生蛋白受体ⅠA(bone morphogenetic protein receptorⅠA,BMPRⅠA，又名ALK3)在心脏发育及心肌细胞的分化中起重要作用，并与室间隔缺损形成有关[1,2]。……