刘长乐 ，李广平 ，郑心田 ，孟恒星 ，邱录贵 ，娄建石

（1.天津医科大学第二医院心脏科，天津300211；2.中国协和医科大学血液病学研究所，天津300020；3.天津医科大学药理学教研室，天津300070）

骨髓（bonemarrow，BM）中包含有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs属混杂细胞群，其表面抗原标志尚未完全确定。MSCs作为多能干细胞具有可塑性，有报道显示在细胞因子作用下可以在体外诱导分化为骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞、上皮细胞和血管内皮细胞，并且参与体内组织新生、损伤修复和重建[1]。本实验应用改进的密度梯度离心法、差异贴壁法和酶消化法建立MSCs的体外培养扩增模型，寻找高度特异性的表面抗原，以利于干细胞移植的广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）BM：39岁男性健康志愿者5mL。（2）仪器：FACScar流式细胞仪（Beckman-Coulter），倒置相差显微镜（OLYMPUS），荧光显微镜（OLYMPUS），恒温培养箱（Forma Scientific），高速低温离心机（Beckman-Coulter），细胞计数仪 KX21型（SYSMEX）。（3）试剂和材料：人淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品公司）、DMEM/F12+MCDB培养基（Invitrogen），FCS（hyclon），IGF（pepro tech），bFGF（pepro tech），EGF （pepro tech），CD34 IgG（Coulter），KDR IgG （R&D Systems），CD44 FITC（Genevale），CD45 FITC（Coulter），CD54 FITC（B&D），CD73 PE（B&D），CD90 FITC （B&D），CD105 PE（Laboratories），CD106 PE（Biole gend），IgG-FITC/PE（B&D）。

1.2 方法

1.2.1 MSCs的原代培养 抽取BM液5mL，肝素抗凝。DMEM+F12培养液稀释后，用人淋巴细胞分离液Ficoll（比重为1.077）密度梯度离心法，分离出单个核细胞。用DMEM+F12洗涤后，加入DMEM+F12与MCBD的混合培养液，并加入10%胎牛血清（FCS）、2 ng/mL bFGF、10 ng/mLEGF、10 ng/mL IGF。24 h后弃去未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每4d半量换液，倒置相差显微镜每天观察生长情况，苏木-伊红（HE）染色观察摄片。

1.2.2 MSCs的传代培养 生长12 d后近融合时，用2mL 0.25%的胰蛋白酶+0.02%EDTA的消化液消化，以1:2～1:3传代。每天观察生长情况。

1.2.3 表面抗原检测 收集培养细胞，取1×104个细胞用PBS调整到100μL，经多聚甲醛固定后用流式细胞分析仪检测 CD34、CD45、CD54、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和KDR阳性表达百分比。……