肖咏梅,毛 璞,栗俊田,杨亮茹,屈凌波

(河南工业大学化学化工学院,河南郑州 450001)

黄酮类化合物酶促衍生化的研究进展

肖咏梅,毛 璞,栗俊田,杨亮茹,屈凌波

(河南工业大学化学化工学院,河南郑州 450001)

黄酮类化合物具有多种生理活性,但大部分天然黄酮脂溶性或水溶性较差,存在口服生物利用度低等缺点,通过衍生化方法可改善黄酮类物质的溶解性.酶的高效性和选择性为其改性研究提供了帮助,综述了黄酮类化合物的酶促衍生化研究的新进展.

黄酮类化合物;酶;衍生化

0 前言

随着食品工业的发展与人们消费观念的改变,含有天然活性成分的保健食品成为现代人追求的目标.其中黄酮类化合物以纯天然、高活性、作用广泛等特点日益受到人们的关注.黄酮类物质具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、防止动脉硬化等多种生理活性[1],但由于大部分天然黄酮脂溶性或水溶性较差,存在口服生物利用度低等缺点,研究者通过衍生化方法,改善黄酮类物质的亲水亲油性,使其更广泛更好地应用于食品、化妆品和药剂配置中.由于黄酮类化合物结构中具有结构相似的反应基团如羟基,传统化学催化改性的方法会使产物变得复杂,而选择酶做催化剂,因其选择性强,反应条件温和,成为当前研究的热点.自 1984年 Klibanov[2]首次把酶的应用从水介质拓展到非水介质以来,由于酶在有机介质中具有极高的热稳定性,选择性强,可减少副反应发生的特点,所以非水介质中的酶催化已经被用到有机合成、手性合成或拆分、药物改性、生物表面活性剂合成、聚合物制备等众多研究领域[3-4].作者综述了黄酮类化合物的酶促衍生化的研究进展.

1 酯化

1.1 槲皮苷类的酶促酯化

槲皮苷类结构中具有伯羟基、仲羟基、酚羟基3种类型的羟基.酶催化合成异槲皮苷酯时,酰化位置选择性的发生在 6′′-位伯羟基上,如果没有伯羟基则发生在 3′′-位仲羟基上,母体上的酚羟基没有发生反应.而槲皮苷只有仲羟基和酚羟基两种羟基类型,酰化位置发生在 4′′-位的仲羟基上.Stevenson[5]报道 ,在 2-甲基 -2-丙醇作溶剂 ,加入 4Å分子筛,利用 Novzym435催化异槲皮苷与棕榈酸、肉桂酸、苯丙酸等一系列羧酸的酯化反应,生成了葡萄糖 6-位 (伯羟基)取代的异槲皮苷酯,转化率达 25%～95%.

Nakaji ma[6]用由甘薯细胞培养的酶,以三磷酸腺苷作能源提供物,和辅酶 CoA共同作用,用咖啡酸、肉桂酸等芳香酸直接与异槲皮苷酯化,生成一系列芳香酸-6′′-异槲皮苷酯.Salem等[7]以链长为 C4-C18的羧酸为酰化试剂,Novzym435催化酯化异槲皮苷,酰化位置也选择性的发生在糖环的 6-位伯羟基上.Ishihara等[8]以肉桂酸乙烯酯和苯甲酸乙烯酯等芳香乙烯酯为酰化试剂,以Chirazyme L-2或 Amano-PS催化在丙酮或乙腈中合成了一系列异槲皮苷酯,并且提高了热稳定性.酰化部位都选择性的发生在 6′′-的伯羟基上.

在体积比 9︰1的丙酮与吡啶的混合溶剂中,Novozym 435催化下 ,n槲皮苷︰n乙酸乙烯酯=1︰10进行反应,得到 4′′-位取代物,而异槲皮苷在同样的条件下 ,得到的是 3′′,6′′-O-二乙酸酯[9].

De Oliveira[10]研究了 Novozmy435催化异槲皮苷的乙酰化反应,用Monte Carlo-based docking程序和经典力场计算底物与酶空腔的结合模型,在原子水平上解释了糖环的 6′′-OH易于酯化的原因.

1.2 柚皮苷的酶促酯化

Mellou等[11]在无毒有机溶剂中以固定化的假丝酵母脂肪酶催化合成了黄酮单糖酰化衍生物.以丙酮为溶剂 ,n月桂酸乙烯酯︰n柚皮苷≥10︰1时 ,反应 96 h获得最高的转化率,达到 70%.该脂肪酶催化的酰化位置选择发生在伯羟基位置.

Gayot等[12]用 Novozym 435催化棕榈酸直接酯化柚皮苷,以 2-甲基-2-丁醇作溶剂,柚皮苷只有葡萄糖基的 6-OH被酯化,引入了长碳链,并考察了溶剂含水量的影响.Stevenson等[5]在 2-甲基-2-丙醇中以 Novozym 435催化酰化柚皮苷,分别以 C14、C16、C18和 C20的饱和脂肪酸为酰化试剂,主要酰化产物为单酯.以棕榈酸为酰基供体时,产率最高达 95%,氢化肉桂酸 (PPA)为酰基供体时,产率最低为 50%.这种酶显示出高度的选择性,酰化位置都发生在糖环的脂肪族伯羟基上,没有脂肪族伯羟基的化合物不能被酰化.

由于离子液体具有非挥发性、低熔点、良好的导电与导热性、高稳定性和选择性溶解力的特点,Diego等[13]研究发现离子液体替代有机溶剂作为酶促反应的介质,提高了酶的选择性和稳定性,经

供应情况：国内方面，企业主要供应前期预收订单，市场到货有限。出口方面，企业集港发运较快，长江港口和南方港口出货顺畅，企业10月份出口订单基本已排满，11月份仍有少量接单。原料方面，近期硫磺价格理性回调，长江港口硫磺报价1420元/吨，周环比下滑90元/吨；硫酸市场灵活上调20-50元/吨，受硫磺市场价格高位运行，酸企库存持续偏低；合成氨市场总体维稳，局部窄幅调整；磷矿石价格高位坚挺，市场供货偏紧态势有增无减。近期，二铵市场正值秋冬季节过渡期，需求清淡，部分中小型企业停车检修装置，开工率继续下滑，平均约为54%。

Katsoura等[14]首次报道了在离子液体中选择性合成柚皮苷的酰化产物,以 Novozym 435催化柚皮苷与丁酸乙烯酯的酯交换反应,在[bmim]BF4中主要酰化产物为葡萄糖 C-6位的酯化产物,反应 96 h,转化率为 65%.

图3 柚皮苷酰化部位

现有文献报道的柚皮苷上的酯化反应,都因柚皮苷含一分子葡萄糖的结构、具有伯羟基,酶催化酰化反应都发生在葡萄糖 C-6位的伯羟基上.

1.3 芦丁的酶促酯化

芦丁是一种天然黄酮类化合物,它的糖苷部位由一分子葡萄糖和一分子鼠李糖相连,结构中只有仲羟基和酚羟基.

Ardhaoui等[15]报道了枯草杆菌蛋白酶 (Subtilsin)的催化下,芦丁与丁酸三氟乙酯在吡啶中的酯化,得到 3′′-位的仲羟基上的酯化产物,48 h后转化率为 65%.Viskupicova等[16]用 CAL B催化芦丁与 C4-C18不同链长的脂肪酸酰化,酰化反应主要发生在葡萄糖的 3′′-OH上,其次是鼠李糖的 4′′′-OH上,得到亲油性的芦丁衍生物,产率达 27%～62%.产物对油基质食品的保存有重要意义.

Mellou等[17]研究了芦丁在丙酮中 50℃下,Novozym 435催化,与不同的单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸发生酰化反应,酰化位置选择性的发生在鼠李糖上的 4′′′-OH仲羟基上,如图 4所示.以油酸为酰化试剂时,转化率为 70%.不同溶剂对反应影响很大,芦丁与油酸反应,在丙酮中96 h后转化率为 70%,在 2-甲基-2-丙醇中转化率仅为 37%,而在四氢呋喃中几乎不反应.

图4 芦丁在不同酶催化下的酰化部位

Lue等[18]研究了室温离子液体 (RTI L)结构对芦丁酶促酰化的影响,考察了 14种不同结构的离子液体发现,阴离子比阳离子对脂肪酶活性影响更大.

从现有研究报道看出,枯草杆菌蛋白酶催化芦丁酰化时一般选择性发生在 3′′-位的仲羟基,而 Novozym 435催化时选择性酰化葡萄糖的 3′′-OH和鼠李糖的 4′′′-OH.

1.4 根皮苷的酶促酯化

图5 根皮苷-6′′-O-肉桂酸酯的结构

1.5 其他黄酮类化合物的酶促酯化

Thomas等[20]报道了在室温离子液体中用固定化鞣酸酶 (tannase)催化合成没食子酸儿茶素酯.在儿茶素与没食子酸酶催化合成表儿茶素没食子酸酯时,7种室温离子液体被用作反应介质,其中 6种被证明是酯化反应的合适溶剂.当溶剂含水量高于 20%时会导致反应产率降低.

Katsoura等报道在离子液体 ([bmi m]BF4和 /或[bmim]PF6)中以 Novozym 435催化七叶苷与乙烯丁酯的酯交换反应,主要酰化产物为葡萄糖C-6位的酯化产物[14].

图6 七叶苷酰化部位

根据文献报道,超声波的作用可促使某些化学反应发生或对反应有加速作用.当其作用于分散在介质中的酶分子时,超声波释放出的能量会促使酶分子的构象发生改变,生物学功能可能会得到加强.肖咏梅等[21-22]以二酸二乙烯酯为酰化供体,通过酶促酯交换反应对曲克芦丁进行结构优化,选择性的合成了曲克芦丁乙烯酯,并研究了一系列超声条件对酯交换反应的影响,结果显示,150W、80 kHz时反应速率显著增加,并且随着酰化供体链长的缩短,增速作用越显著,曲克芦丁转化率由 56.3%提高到 87.3%.可能的原因是由于超声改变了酶分子的构象,从而增强了酶分子对底物的亲和力.

溶剂是影响酶催化反应的一个重要的因素.Habulin等[23]以 3种酶在不同溶剂中催化香茅醇与月桂酸合成香茅醇月桂酸酯,Novozym 435催化效果最好,选用的丙酮、甲基乙酮、2-甲基-2-丁醇和正庚烷几种介质中,正庚烷效果最好,反应30 min后转化率达到 81%,而在丙酮中反应 30 min后转化率仅为 15%.可见溶剂对酶促反应具有较大影响.

Chang等[24]以 Novozym 435催化 L-抗坏血酸和月桂酸直接酯化合成了 L-抗坏血酸月桂酸酯,在温度为 30.6℃、酶量为 34.5%、反应物摩尔比为 1︰4.3时反应 6.7 h,最高产率为 93.2%.

Singh等[25]研究了多种酶催化选择性酰化环烯醚萜苷,以乙酸乙烯酯与对硝基苯链烷酸酯作为酰化试剂.其中在四氢呋喃溶剂体系中,以 lipase B催化产率最高 (50%).由于胡黄连苷 I(picroside-I)肉桂酸酯的空间位阻,使得糖苷上的伯羟基不能参与酰化反应,因此,酯化位置选择性的发生在糖环上的仲羟基 (C-6)上.

2 酶促羟基化

为了进一步改善大豆苷元的抗癌活性,Roh等[26]利用从枯草芽苞杆菌中得到的 CHY107H1作用于大豆苷元直接进行羟基化得到大豆苷元衍生物 7,4′,3′-三羟基大豆苷元.

图7 大豆苷元酶促羟基化反应

Roh等[27]研究发现 Streptomyces avermitilis MA-4680有很高的邻二羟基活性,用来选择性的催化大豆苷元和染料木素 3′位发生羟基化,分别得到 3′,4′,7-三羟基异黄酮和 3′,4′,5,7-四羟基异黄酮.

3 选择性糖苷化

Yang等[28]报道了 Cel7B-E197S突变体可以直接使黄酮苷元糖苷化,并且有高度的区域选择性,合成了一系列黄酮苷类化合物,如图 8所示.

图8 黄酮的区域选择性糖苷化

4 其他衍生化方法

Wang等[29]首先用 Niu-O16将大豆苷元加氢还原,然后采用 Julong-732和乳酸杆菌两种菌种混合在厌氧条件下,从中得到 S-雌马酚,由于利用的是混合菌种使得 S-雌马酚的产量大大增加.

图9 大豆苷元的加氢还原反应

从以上的综述可以看出,酶在不同介质中对于不同的底物具有可调控性和选择性,酶促反应具有温和、易实现和反应的选择性等优点.选择适合的有机溶剂和相应的酶,不仅有利于提高酶的稳定性,而且提高了反应产率,实现了选择性的合成.非水介质酶催化发展迅速,正在逐步应用于化合物的选择性改性,尤其是天然产物的衍生化,由于产物组成较化学催化的可控,利于进一步的开发和利用.在未来的研究中,一种全新的生物催化剂将应用于化学和制药工业.酶催化黄酮类化合物的改性以提高其药理、生理活性,具有广阔的应用前景.

致谢:感谢河南省创新团队和郑州市创新团队对本研究工作的支持.

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PROGRESS IN ENZY MATIC DER I VATIZATI ON OF FLAVONO IDS

XI AO Yong-mei,MAO Pu,L IJun-tian,YANGLiang-ru,QU Ling-bo
(School of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China)

Flavonoids have a variety of physiological activities,but the majority of natural flavonoids have poor lipid solubility orwater solubility and low oral bioavailability.The derivatization method can improve the solubility of flavonoids,and enzymeswith high efficiency and selectivity are good to the modification of flavonoids.The paper summarized the progress of enzymatic derivatization of flavonoids.

flavonoids;enzyme;derivatization

TS201.2

A

1673-2383(2011)01-0078-05

2010-10-28

河南省科技攻关项目(82102330014);郑州市科技局攻关项目(2010GYXM639)

肖咏梅 (1969-),女,河南郑州人,博士,副教授,研究方向为天然产物的改性和酶促合成.