单小云，楼宏强，胡 野，楼 景，屠平光，方 萍

并殖吸虫是重要的食源性人兽共患并殖吸虫病的病原体。全球已报告有50多种，我国报告的虫种多达29种，其中有些是同物异名，对于并殖吸虫虫种的独立性长期以来存在着较多争议［1］。近些年国内外学者从形态学、生活史、分子水平等方面探讨我国不同地区的并殖吸虫的遗传变异及分类，其中分子生物学技术的发展为并殖吸虫虫种分类研究提升到新的水平提供了条件。本研究采用简单重复序列锚定 PCR（simple sequence repeat－anchored PCR，SSR－PCR）对我国5个地区的并殖吸虫的遗传变异进行研究，并与常规PCR进行比较，以了解并殖吸虫不同地域株的遗传变异情况，为并殖吸虫的分子生物学技术分类提供依据。

1 材料与方法

1．1 标本及其镜下观察 从浙江金华、永嘉，福建平和、政和、周宁的并殖吸虫病流行区采集淡水蟹，以双筛水洗法分离到5地的溪蟹囊蚴。各地标本随机选取10个囊蚴于解剖镜下进行形态学观察，测量囊蚴大小、内外壁厚度，初步判断并殖吸虫虫种。

1．2 囊蚴基因组DNA的提取 按照Promega公司基因组DNA提取试剂盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）使用说明书提取成虫基因组DNA。

1．3 PCR扩增

1．3．1 引物设计

1．3．1．1 SSR－PCR 引物设计 参照文献［2－3］的方法，选用引物5’－（CA）8RY－3’，即5’－CACACACACACACACARY－3’，共18个碱基。

1．3．1．2 常规PCR引物设计 根据COI和ITS2基因序列［4］，自行设计引物，COI基因引物序列为：上游5’－CCT GAT TTT GCC TGG GTT

TG－3’，下游5’－ACG ACG AAC CAC GTA TCA T－3’。ITS2基因引物序列为：上游5’－ATA TTG CGG CCA CGG GTT A－3’，下游5’－GGT ACT CAC GTC TGA TCC G－3’。

上述引物委托上海Invitrogen公司合成。

1．3．2 PCR反应体系和条件

1．3．2．1 SSR－PCR扩增反应体系及条件 参照文献［5－6］的方法，总反应体系：DNA 模板2．5μL、10×PCR缓冲液2．5μL、dNTP混合物（2．5mmol／L）2 μL、Ex Taq酶（5U／μL）0．25μL、引物（10μmol／L）0．5μL，加ddH2O至25μL。PCR反应条件为：95℃4min；……