赵 勇，张 海，赵善民，伍 静，毛峰峰，郭晓雅，张彩勤，师长宏

2.第四军医大学西京医院呼吸内科；西安 710032

全球目前约1/3人口处于结核分枝杆菌（Mycobacterium，tuberculosis，MTB）持续感染状态，5%～10%感染者有可能最终发展为活动性结核病（tuberculosis，TB），并成为传播 MTB的重要传染源。耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis，Ms）是一种生长快、转化效率高的非致病菌和强的细胞免疫佐剂，其表达的外源蛋白可达MTB的5～10倍，单位时间内分泌的蛋白产量可比MTB增加50～100倍，且对人、小鼠和豚鼠均不致病，因此可代替卡介苗（BCG）而被发展成疫苗载体［1］。

我们将MTB的肝素结合血凝素蛋白（Heparin Binding Hemagglutinin，HBHA）基因和人白细胞介素（interleukin，IL）12基因融合，构建成能携带外源基因并介导其在Ms宿主分泌表达的重组Ms，并对其蛋白的表达和表达的稳定性水平进行了测定。以期获得一种用于MTB治疗的候选疫苗。

1 材料与方法

1.1 材料 大 肠 杆 菌 DH5α、结 核 分 枝 杆 菌H37Rv、耻垢分枝杆菌（Ms）以及穿梭质粒pSMT3由本实验室保存。克隆载体p MD18T、Ex Taq DNA聚合酶、T4链接酶、限制性内切酶BamH I、SalI、SphI、Hind III以及DL2000、异丙基硫代－β－D半乳糖苷（IPTG）均购自大连 Ta KaRa公司；HBHA m Ab为本实验室筛选，hIL12 p Ab购自美国SANTA公司，FITC标记的羊抗鼠和羊抗人IgG购自博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HBHA及hIL12基因的引物设计 参考GenBank发表的HBHA及hIL12基因序列设计引物，见表1。由北京奥科生物有限公司合成。HBHA F和HBHA R分别引入BamH I和SalI，同时去掉HBHA基因的终止密码TAG；由于hIL12是由P40和P35两个亚基组成，为了保证HBHA和hIL12两亚基的正确折叠，分别在hIL12 P40 F和hIL12 P35 F的引入48 bp和30 bp的Linker及SalI和SphI位点，同时在hIL12 P40 R突变掉TAG终止密码。考虑到后续穿梭载体的构建，我们利用巢式PCR对P35基因542 bp处的BamH I进行点突变设计。利用巢式PCR对BamH I进行点突变。……